去質子化劑活化的Novozym 435催化無定形蔗糖合成月桂酸蔗糖單酯

賀朦迪，張珂睿，陳小龍，范永仙，陳翰馳，朱林江，陸躍樂*

1(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州，310014)2(浙江工業大學 化學工程學院，浙江 杭州，310014)

脂肪酸蔗糖酯是一種非離子型表面活性劑，具有安全無毒、生物相容性好、可生物降解等優點，因此被廣泛應用于食品、日化品、制藥等行業[1-7]。例如，蔗糖酯是聯合國國際糧農組織和世界衛生組織推薦使用的食品添加劑[8]。

目前工業化生產蔗糖酯主要采用化學法，但是存在高能耗、副產物多、溶劑毒性大等缺點。相比之下，酶法合成蔗糖酯則具有區域選擇性好、反應條件溫和、產品安全性高等優點，近年來日益引起人們的關注[9]。大部分研究者將叔戊醇/二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)二元體系作為反應介質以促進蔗糖的溶解[10-12]。如FERRER等[12]報道了H.lanuginosa在叔戊醇/DMSO(叔戊醇的體積分數為80%)體系中催化月桂酸蔗糖單酯的合成，產量可達到30 g/L。但是，DMSO沸點高且毒性大，不利于月桂酸蔗糖單酯的純化和應用[9]。因此，使用叔戊醇等低毒性、易處理的溶劑作為反應介質具有重要意義。

酶在非水介質中的電離狀態對其催化活性的影響往往會被人們忽視。與水相催化不同，有機介質的介電常數通常較低[13]，導致酶中的帶電氨基酸與介質中帶相反電荷的“反離子”緊密結合，從而改變酶的電離狀態，影響酶的催化特性。例如，PARTRIDGE等[14]發現在枯草桿菌蛋白酶催化N-乙酰-L-酪氨酸乙酯與正丙醇的酯交換反應中，在四氫呋喃中加入固態緩沖對-AMPSO/NaAMPSO，可使反應速率從2.2 nmol/(mg·min)提升至52 nmol/(mg·min)[15]?？莶輻U菌蛋白酶與脂肪酶同屬于絲氨酸水解酶，然而，目前并沒有關于調控脂肪酶電離狀態以提高其催化合成蔗糖酯活性的報道。

蔗糖由于其較高的晶格能在叔戊醇中的溶解度很低(<1 g/L)，極大地限制了蔗糖酯的產量[16]。通過破壞糖類的晶體結構可得到無定形糖類，以提高糖類在有機溶劑中的溶解度和溶解速率[17]。例如，FLORES等[18]發現無定形β-葡萄糖在叔戊醇中的溶解度為21 mmol/L，高于晶體β-葡萄糖(17.9 mmol/L)，當采用Novozym 435催化無定形β-葡萄糖合成月桂酸葡萄糖酯時，反應速率可從12 μmol/(g·min)提升至16 μmol/(g·min)。然而，目前并沒有關于使用無定形蔗糖合成月桂酸蔗糖單酯的報道。

本研究以叔戊醇為反應介質，以無定形蔗糖和月桂酸乙烯酯為底物，使用去質子化劑活化的Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯，并對該體系進行底物添加量、溫度、酶添加量等因素的優化，所得月桂酸蔗糖單酯產量從1.04 g/L提高到23.2 g/L，并且對月桂酸蔗糖單酯合成的區域選擇性很好，實現了在低毒性有機體系中獲得較高蔗糖酯產量的目標。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

蔗糖、4?分子篩、叔戊醇、月桂酸鈉、酪蛋白酸鈉等，國藥集團化學試劑有限公司；月桂酸乙烯酯、月桂酸蔗糖酯，阿拉丁試劑(上海)有限公司；Novozym 435，諾維信(中國)生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

1260 Infinity II型高效液相色譜儀、1260 Infinity II型蒸發光檢測器，美國安捷倫公司；Nucleosil C18色譜柱 (5 μm, 250 mm×4.6 mm，100A)，濟南賽暢科學儀器有限公司；圓底燒瓶(50 mL)、三頸燒瓶(50 mL)、冷凝管、75 mm研缽，國藥集團化學試劑有限公司；硅膠GF254薄層板，青島海洋化工廠；DK-8B恒溫水浴鍋，浙江明德儀器有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；ADL311/311S噴霧干燥器，浚和(上海)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 無定形蔗糖的制備

沿用ADHIKARI等[19]報道的噴霧干燥法制備無定形蔗糖：先在500 mL純水中加入1.25 g酪蛋白酸鈉，50 ℃下緩慢攪拌直至徹底溶解，再加入123.75 g蔗糖，完全溶解后制得質量分數為20%的蔗糖溶液(酪蛋白酸鈉可防止無定形蔗糖相互粘連及附著在噴霧干燥器器壁上)。將上述蔗糖-酪蛋白酸鈉溶液進行噴霧干燥，條件為：水分蒸發速率2 kg/h、進口溫度170 ℃、出口溫度70 ℃，所得無定形蔗糖在60 ℃真空干燥箱中干燥6 h后備用，最終收率為82.7%。

1.3.2 月桂酸蔗糖單酯的合成

在50 mL圓底燒瓶中加入15 mL叔戊醇、一定量的蔗糖(研磨后的晶體蔗糖或無定形蔗糖)、月桂酸乙烯酯、去質子化劑、Novozym 435和4?分子篩，在特定溫度的水浴鍋中反應24 h后，使用薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)及HPLC分析月桂酸蔗糖單酯的含量。當反應溫度≥70 ℃，使用回流反應裝置以防止溶劑的逸散。

1.3.3 TLC分析

沿用李延科等[20]報道的方法，以硅膠G板為固定相，V(甲苯)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水)=10∶5∶4.5∶0.2為展開劑，在蔗糖酯上行展開后，用脲-磷酸-水飽和正丁醇溶液顯色，斑點呈藍色。

1.3.4 HPLC檢測

使用美國安捷倫公司的高效液相色譜儀、Nucleosil C18色譜柱 (5 μm, 250 mm×4.6 mm, 100A)、蒸發光檢測器進行HPLC檢測。以體積分數為90%的甲醇作為流動相，流速1.1 mL/min，柱溫為40 ℃。

2 結果與分析

2.1 去質子化劑對酶活性的影響

在酯交換反應中，?；w水解產生的少量有機酸會使酶處于質子化狀態，大大降低酶的催化活性[14]。因此，推測在反應體系中加入堿性物質作為去質子化劑，可減少酸性副產物對酶活性的抑制作用。

本實驗在15 mL叔戊醇中加入3 g/L晶體蔗糖，0.15 mol/L月桂酸乙烯酯，6.7 g/L Novozym 435，20 g/L分子篩，反應溫度為60 ℃，同時分別加入2 g/L的月桂酸鈉、甲酸鈉、乙酸鈉、磷酸氫二鈉及20 μL的三乙胺作為去質子化劑調控Novozym 435的電離狀態，結果如圖1所示，相比于對照組，上述去質子化劑對Novozym 435均有明顯的活化作用，其中月桂酸鈉對酶活性的提升效果最好，反應24 h后，月桂酸蔗糖單酯的產量從1.04 g/L提升至2.1 g/L。

圖1 不同類型的去質子化劑對Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯的影響Fig.1 The effect of different deprotonants on the catalytic synthesis of sucrose laurate monoester by Novozym 435

隨后，在以上催化條件下對月桂酸鈉的添加量進行優化。如圖2所示，當月桂酸鈉的添加量>2 g/L時，Novozym 435的酶活性不再提升，可能是因為月桂酸鈉在叔戊醇中的溶解度較低，而只有溶于體系的少量Na+才能起到調控作用[14]。然而，經探究，有機可溶的三乙胺添加量對Novozym 435酶活性的影響也不顯著(文中未顯示數據)。因此，在之后的研究中均在體系中加入2 g/L的月桂酸鈉以活化Novozym 435。

圖2 月桂酸鈉質量濃度對Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯的影響Fig.2 The effect of concentration of sodium laurate on the catalytic synthesis of sucrose laurate monoester by Novozym 435

2.2 晶體蔗糖和月桂酸乙烯酯添加量對月桂酸蔗糖單酯產量的影響

為探究底物添加量對月桂酸蔗糖單酯產量的影響，本實驗在15 mL叔戊醇中加入6.7 g/L Novozym 435，2 g/L月桂酸鈉，20 g/L分子篩，反應溫度為60 ℃，此外分別加入不同濃度的底物。如表1所示。當晶體蔗糖添加量為0.03 mol/L，月桂酸乙烯酯添加量為0.15 mol/L時，反應24 h后月桂酸蔗糖單酯的產量為4.26 g/L，遠高于蔗糖添加量為0.01 mol/L時的產量(2.02 g/L)?？赡苁且驗轶w系中存在較多未溶解的蔗糖，可以及時補充反應所消耗的蔗糖；但當晶體蔗糖添加量>0.03 mol/L時，體系中大量未溶解的蔗糖會增大傳質阻力，抑制反應的進行[21]。與蔗糖不同，月桂酸乙烯酯在叔戊醇中的溶解性較好，當乙烯酯濃度<0.15 mol/L時，月桂酸蔗糖單酯的產量隨乙烯酯添加量的增加而提高。當乙烯酯濃度進一步增加時，月桂酸蔗糖單酯產量略有下降，可能是因為體系中存在大量的乙烯酯會抑制蔗糖的溶解。

表1 晶體蔗糖和月桂酸乙烯酯加量對月桂酸蔗糖單酯產量的影響Table 1 The effect of concentration of crystalline sucrose and vinyl laurate on the yield of sucrose monolaurate

2.3 溫度對月桂酸蔗糖單酯產量的影響

之前的研究表明，Novozym 435對高溫的耐受性較強。如Novozym 435可在82 ℃下催化蔗糖與月桂酸乙酯的酯交換反應(叔丁醇回流體系)，反應7 d后月桂酸蔗糖單酯的產率達到35%[16]。為探究溫度對月桂酸蔗糖單酯產量的影響，本實驗在15 mL叔戊醇中加入0.03 mol/L無定形蔗糖，0.15 mol/L月桂酸乙烯酯，6.7 g/L Novozym 435，2 g/L月桂酸鈉，20 g/L 分子篩，并在不同溫度下反應，結果如圖3所示。當反應溫度≤75 ℃時，月桂酸蔗糖單酯產量隨溫度的升高而增加，在75 ℃時,月桂酸蔗糖單酯產量最高，達到6.42 g/L。這是因為溫度升高可使蔗糖在叔戊醇中的溶解度增加，促進反應的進行。隨著溫度進一步上升，月桂酸蔗糖單酯產量逐漸下降，可能是因為溫度過高會降低脂肪酶的活性和穩定性，且易使月桂酸蔗糖單酯變性著色，從而降低產量。因此，該反應的最適溫度為75 ℃。

圖3 溫度對Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯的影響Fig.3 Effect of temperature on the catalytic synthesis of sucrose laurate monoester by Novozym 435

2.4 無定形蔗糖對月桂酸蔗糖單酯產量的影響

蔗糖在反應體系中的溶解度及溶解速率是影響蔗糖酯產量的又一關鍵因素。糖類在有機溶劑中的溶解度主要取決于其晶格能大小，體現在糖類的熔點上。一般來講，糖類的熔點越高，晶格能越大，在有機溶劑中的溶解性越差，而蔗糖正是一種晶格能較高的糖類(熔點約為185 ℃)。因此，為驗證無定形蔗糖是否具有改善蔗糖在叔戊醇中的溶解特性，實現對月桂酸蔗糖單酯合成的促進作用。本實驗在15 mL叔戊醇中加入0.15 mol/L月桂酸乙烯酯，6.7 g/L Novozym 435，2 g/L月桂酸鈉，20 g/L分子篩，反應溫度為75 ℃，此外，分別加入0.03 mol/L無定形蔗糖和晶體蔗糖，結果如圖4所示。使用無定形蔗糖可使月桂酸蔗糖單酯產量(24 h)從6.42 g/L提升至11.1 g/L，因此，在之后的研究中均采用無定形蔗糖作為酰基受體合成月桂酸蔗糖單酯(對照組除外)。

圖4 無定形蔗糖對Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯的影響Fig.4 Effect of amorphous sucrose on the catalytic synthesis of sucrose laurate monoester by Novozym 435

為探索無定形蔗糖和和月桂酸乙烯酯的添加量對月桂酸蔗糖單脂產量的影響，本實驗在15 mL叔戊醇中加入6.7 g/L Novozym 435，2 g/L月桂酸鈉，20 g/L分子篩，反應溫度為75 ℃，此外，分別加入不同濃度的無定形蔗糖和月桂酸乙烯酯，結果如表2所示。由表2可知，當無定形蔗糖添加量為0.09 mol/L，月桂酸乙烯酯添加量為0.15 mol/L時，月桂酸蔗糖單酯產量可達到最高值13.71 g/L，轉化率為29.1%(24 h)，因此將無定形蔗糖添加量為0.09 mol/L，月桂酸乙烯酯添加量為0.15 mol/L定為最佳底物添加濃度。

表2 無定形蔗糖和月桂酸乙烯酯添加量對月桂酸蔗糖單酯產量的影響Table 2 The effect of concentration of amorphous sucrose and vinyl laurate on the yield of sucrose laurate monoester

2.5 酶添加量對月桂酸蔗糖單酯產量的影響

為探究酶添加量對月桂酸蔗糖單酯產量的影響，本實驗在15 mL叔戊醇中加入0.09 mol/L無定形蔗糖，0.15 mol/L月桂酸乙烯酯，2 g/L月桂酸鈉，20 g/L分子篩，反應溫度為75 ℃，結果如圖5所示，當Novozym 435的添加量≤10 g/L時，月桂酸蔗糖單酯產量隨酶加量的增加顯著提升，繼續增大酶添加量，蔗糖酯產量緩慢提升，在Novozym 435 的添加量為16.7 g/L時，月桂酸蔗糖單酯產量達到最大值16.6 g/L(24 h)，酶添加量>16.7 g/L時，月桂酸蔗糖單酯產量逐漸下降，主要是因為體系中存在過量的酶會增大傳質阻力，抑制反應的進行[22]，因此最佳的酶添加量為16.7 g/L。

圖5 酶添加量對Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on the catalytic synthesis of sucrose laurate monoester by Novozym 435

2.6 反應時間對月桂酸蔗糖單酯產量的影響

為探究反應時間對月桂酸蔗糖單酯產量的影響，同時考察無定形蔗糖和晶體蔗糖作為底物時最適轉化結果，本實驗在15 mL叔戊醇中加入0.15 mol/L月桂酸乙烯酯，16.7 g/L Novozym 435，2 g/L月桂酸鈉，20 g/L分子篩，反應溫度為75 ℃，再分別加入0.09 mol/L晶體蔗糖和無定形蔗糖，結果如圖6所示，使用無定形蔗糖作為底物，在60 h后反應達到平衡，在該反應條件下，可得到最高的產物濃度和最佳的轉化率，此時月桂酸蔗糖單酯質量濃度為23.2 g/L，轉化率為49.2%；使用晶體蔗糖作為底物，反應平衡時(55 h)月桂酸蔗糖單酯質量濃度為14.9 g/L，轉化率為32.5%。

圖6 反應時間對Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯的影響Fig.6 Effect of reaction time on the catalytic synthesis of sucrose laurate monoester by Novozym 435

3 結論與展望

相比于化學法，脂肪酶催化合成蔗糖酯具有區域選擇性高、反應條件溫和、產品安全性高等優點[23-24]。然而，絕大部分研究者仍以含少量DMSO的叔戊醇作為反應介質，加大了蔗糖酯純化的難度并使其在食品等領域中的應用受限。

本研究以低毒性的叔戊醇作為反應介質合成月桂酸蔗糖單酯。通過加入去質子化劑調控Novozym 435的電離狀態，以減小酰基供體水解產生的少量月桂酸對酶活性的抑制作用，并以無定形蔗糖作為底物，提高蔗糖在叔戊醇的溶解度及溶解速率，使得反應速率進一步提升。實驗表明，在15 mL叔戊醇中，加入0.09 mol/L無定形蔗糖、0.15 mol/L月桂酸乙烯酯、16.7 g/L Novozym 435，2 g/L月桂酸鈉及20 g/L分子篩，在75 ℃下反應60 h，月桂酸蔗糖單酯的質量濃度達到23.2 g/L，轉化率達到49.2%，已接近報道中在叔戊醇/DMSO(叔戊醇的體積分數為80%)體系中合成蔗糖酯的產量，實現了一種綠色安全、高效、低成本的月桂酸蔗糖單酯生產方式，為今后的工業化應用奠定了基礎，也為同類產品的開發提供了一個新的工藝優化思路。