紅球菌染料脫色過氧化物酶的異源表達及活性分析

皮倩，夏榮，唐蕾,*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

血紅素過氧化物酶屬于氧化還原酶類，通常使用過氧化氫作為電子受體催化底物的氧化[1]，這類酶需要結合血紅素作為輔基以全酶的形式才具有活性。染料脫色過氧化物酶(dye-decolorizing peroxidase，DyP)屬于血紅素過氧化物酶超家族中新的一類，基因組分析顯示，DyP廣泛存在于真菌和細菌中，與植物來源的血紅素過氧化物酶類似,需要結合血紅素輔因子形成全酶[2]。然而結構分析表明，DyP具有類似于亞氯酸鹽歧化酶的鐵氧還原蛋白折疊，因此屬于與植物型過氧化物酶不同的超家族[3]。依據系統發育分析可將DyP分為4個亞科(A～D)：A類酶含有Tat依賴的信號序列，表明其參與胞質外或細胞外的生理活動[4-6]；B類和C類被推定為胞質酶，參與細胞內代謝[7]；D類主要包含真菌變體，具體功能還需進一步研究[8]。本研究使用的DyP(RhDypB)來自紅球菌(Rhodococcusjostii)，該酶在Mn2+存在下活性有所提高[9]，并且能夠催化木質素模型分子的β-芳基醚的Cα—Cβ鍵的裂解[10]。為了更好地發揮DyP在工業中的應用價值，通常采用基因工程的方法生產DyP重組蛋白。大腸桿菌由于其繁殖快、成本低、操作簡便、可大規模高密度發酵培養等優點是最常用的表達宿主之一。

大腸桿菌通常以C5途徑合成血紅素[12]。關于重組血紅蛋白最新研究表明，血紅素輔因子的充足供應是血紅蛋白形成的重要因素，血紅素摻入到蛋白形成全酶對后續酶的溶解度及活性至關重要[13]。通常對大腸桿菌血紅素生物合成的調節是生產重組血紅素蛋白的最主要因素[14]。例如，顧鵬帥等[15]將來源于褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)的染料脫色過氧化物酶基因(TfuDyP)與大腸桿菌(EscherichiacoliBL21)谷氨酰-tRNA還原酶基因(hemA)共表達，使酶活性提高了110%；RAMZI等[16]將來自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的DyP與來自鼠傷寒沙門氏菌LT2(SalmonellatyphimuriumLT2)的hemA和來自E.coliBL21的hemL共表達使酶活性由39.0 U/mg增加至66.7 U/mg；朱竹兵等[17]在重組TfuDyP發酵培養基中添加氯高鐵血紅素、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)、谷氨酸、FeCl2發現均可提高酶活性，5-ALA添加量為400 μmol/L，酶活性最大達到65 U/L。目前DyP的晶體結構有些已被解析出來，越來越多來自不同菌株的染料脫色過氧化物酶基因被克隆出來，在大腸桿菌中表達，性質也被表征，同時該酶在處理染料廢水、造紙工業紙漿漂白以及農業小麥秸稈的水解方面具有較好的潛能，雖然已經有許多關于染料脫色過氧化物酶的研究，但是該酶的生理作用還尚不明確。

目前關于來自細菌紅球菌DypB的研究是比較具體和深入的，有研究表明用丙氨酸代替第246位的天冬酰胺，該酶的催化活性有所提高，氧化Mn2+的Kcat和Kcat/Km值分別提高80和15倍[9]，因此，本研究以第246位的天冬酰胺被丙氨酸替代后的DypB基因序列來克隆重組，pET-24b (+)為載體，將RhDypB基因在E.coliBL21(DE3)中進行了異源表達，并比較了外源添加5-ALA和內源過表達5-ALA合成關鍵酶基因hemA對胞內血紅素濃度以及RhDypB活性的影響，揭示了重組血紅素蛋白的可行性，同時為該酶進一步的相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒

本實驗中所用菌株和質粒見表1。

表1 本研究中使用的質粒和菌株Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑和儀器

ABTS，Sigma 公司；活性藍19(reactive blue 19，RB19)，國藥集團；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate,Kan)，上海生工；質粒提取、純化試劑盒，Bradford Protein Assay Kit，TaKaRa公司；5-氨基乙酰丙酸，梯希愛化成工業發展有限公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；AKTA avant 25蛋白純化儀，美國GE公司；蛋白電泳儀、凝膠成像儀，Bio-Rad公司；多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.1.3 培養基

1.2 方法 所有新生兒黃疸患兒均給予基礎治療，包括補充能量、補充體液、補充礦物質和維生素；單面藍光照射，為避免照射對皮膚造成傷害，需要在進行12 h的照射后停歇12 h再繼續，患兒每天需要口服苯巴比妥片劑，劑量為1次/d，若患兒出現膽紅素上升過快的情況，則需要給患兒補充劑量為1 g·kg-1的白蛋白。

LB液體培養基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0。

LB固體培養基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂20，pH 7.0。

TB液體培養基：酵母提取物24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，甘油8 mL/L，K2HPO49.4 g/L，KH2PO42.2 g/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒的構建

RhDypB(NCBI accession number MH292860)的全長核酸序列由南京金斯瑞有限公司優化并合成，并將其插入對應于NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)限制性酶切位點的質粒pET-24b(+)，得到重組質粒(pDypB)，將載體上的6個密碼子(編碼6個組氨酸)與RhDypB基因的3′-末端融合以進行后續純化。hemA基因利用NCBI 上已公開的序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM946981.2)設計引物：hemAFGGATAACAATTCCCCTCTAGAATGACCCTTTTAGTAGCACTCGGTATC和hemARTTAAACAAAATTATTTCTAGACT-ACTCCAGCCCGAGGCTG進行PCR，使用 ClonExpress II One Step Cloning Kit，將PCR純化后產物與XbaI酶切后的線性化載體，按照說明書上的操作步驟進行連接，得到重組質粒(pHemA-DypB)(圖1)。將重組質粒轉入大腸桿菌JM109感受態細胞中，挑取卡那霉素抗性平板上的單菌落，經 LB液體培養基培養，并取適量菌液提取質粒進行酶切驗證和基因測序(天霖生物科技無錫有限公司)。引物中的酶切位點用下劃線標出，斜體表示同源序列。

a-重組質粒pDypB；b-重組質粒pHemA-DypB圖1 重組質粒示意圖Fig.1 Schematic representation of recombinant plasmids

1.2.2 重組質粒的誘導表達

將重組質粒pDypB和pHemA-DyPB分別轉入E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，挑取卡那霉素抗性平板上的單菌落，菌落PCR驗證正確后，在LB液體培養基中培養，以4%接種量接種于含有50 mg/L Kan的TB液體培養基中。當OD600達到1.0時，在培養基中添加0.25 mmol/L IPTG進行誘導，在20 ℃下培養18 h后，離心收集菌體，將菌體懸浮在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中，超聲破碎后，以8 000 r/min離心30 min收集上清液，用0.22 μm膜過濾，得到RhDypB的粗酶液。

1.2.3 染料脫色過氧化物酶的純化

使用HisTrap HP 鎳柱親和層析純化粗酶液，用含20 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)平衡后上樣，然后用含500 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)進行線性洗脫。根據洗脫曲線，收集與洗脫峰相對應的酶溶液，使用12% SDS-PAGE對酶液中的蛋白進行定性分析。

1.2.4 染料脫色過氧化物酶的光譜分析

利用熒光法分析重組菌株的胞內血紅素濃度[14]。

通過多功能酶標儀分析所純化的酶在280～700 nm的吸收光譜，RhDypB在408 nm處有特征吸收峰，用A408/A280值來表征酶與血紅素的結合程度。

1.2.5 染料脫色過氧化物酶活性檢測

酶活性利用ABTS來檢測，反應體系包括1 mmol/L ABTS，6 mmol/L MnCl2以及50 mmol/L丙二酸鈉緩沖液 (pH 5.0)，2 μL酶液在25 ℃溫育5 min后，加入1 mmol/L H2O2啟動反應，反應5 min后加入200 μL SDS終止反應。利用紫外分光光度計檢測420 nm(ε=36 000 M-1cm-1)處的吸光值變化。1個酶活力單位定義為在25 ℃、pH 5.0 條件下，氧化1 μmol/L ABTS 所需要的酶量。蛋白質濃度測定采用Bradford Protein Assay Kit試劑盒，對RhDypB蛋白濃度進行測定。比酶活性計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.6 染料脫色過氧化物酶對染料脫色率的測定

通過檢測在300～700 nm處的染料光譜吸收，確定RB19的最大吸收波長為620 nm, 為了評估酶處理的效率，建立了3 mL反應體系包括0.1 mmol/L RB19，6 mmol/L MnCl2，0.2 mmol/L H2O2, 50 mmol/L醋酸緩沖液 (pH 4.0),10 μL RhDypB，在25 ℃處理24 h后檢測RB19在620 nm處的吸光度，利用染料的脫色率來反映染料的脫色情況，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A0為對照組吸光值，Ai為酶處理24 h后吸光值。

2 結果與分析

2.1 重組菌株的構建及鑒定

2.1.1 pDypB重組菌株的構建

將全長1 077 bp的目的基因RhDypB與載體pET-24b (+)連接得到重組質粒pDypB，用NdeI與XhoI雙酶切并用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證(圖2-a),雙酶切驗證得到2條條帶，分別為pET-24b (+)載體5 303 bp和RhDypB1 077 bp，由天霖生物科技無錫有限公司測序，結果正確，重組質粒構建成功，命名為pDypB。

2.1.2hemA與RhDypB共表達菌株的構建

在大腸桿菌中，hemA基因編碼的谷氨酰-tRNA還原酶催化谷氨酰-tRNA生成谷氨酰-1-半醛，該步驟會受到終產物血紅素的反饋抑制，是細菌血紅素合成中的限速步驟之一[18]，因此考慮將大腸桿菌的hemA基因與RhDypB共表達。以NCBI上獲得的E.coliBL21 基因組序列，利用XbaI酶切位點設計與載體具有同源序列的特異性引物，利用PCR擴增將hemA與pET-DypB進行連接，并進行雙酶切驗證，結果如圖2-b所示。載體連接后進行酶切驗證得到2條條帶，分別為pET-DypB 6 302 bp和hemA1 257 bp，由天霖生物科技無錫有限公司測序，結果正確，重組質粒構建成功，命名為pHemA-DypB。

M-Marker;1-重組質粒pDypB酶切驗證；2～3-重組質粒pHemA-DypB酶切驗證圖2 重組質粒構建的凝膠電泳Fig.2 Gel electrophoresis for recombinant plasmid

2.2 RhDypB的表達與純化

將含有全長1 077 bpRhDypB的pET24b-DypB在E.coliBL21 中進行異源表達，經 IPTG在20 ℃誘導18 h，收集菌體，超聲破碎后離心收集上清液，得到粗酶液，利用鎳柱親和層析，純化后用SDS-PAGE對蛋白進行分析，結果如圖3所示，在40 kDa處有明顯的目的條帶，與理論計算結果一致。以上結果表明重組表達載體經IPTG誘導后在大腸桿菌中成功表達了染料脫色過氧化物酶基因。同時對蛋白濃度進行測定，純化后蛋白質量濃度可達到100 mg/L。

插圖為收集液的 SDS-PAGE分析；M-蛋白Marker；A1～A4-收集的洗脫峰樣品圖3 DypB的色譜純化Fig.3 DypB purification by chromatography

2.3 重組菌株胞內血紅素濃度測定

染料脫色過氧化物酶需要結合血紅素輔因子成為全酶，才具有催化活性，因此大腸桿菌胞內血紅素濃度對酶活影響至關重要。血紅素濃度測定結果如圖4所示，單獨過表達RhDypB菌株pDypB血紅素濃度1.5 μmol/L，而共表達的pHemA-DyPB重組菌株血紅素濃度為2.4 μmol/L，相比于單獨表達RhDypB的菌株血紅素濃度增加了約1.6倍，在菌株pDypB培養基中添加400 μmol/L 5-ALA后，血紅素濃度增加至8.9 μmol/L，與未添加5-ALA的pDypB菌株相比增加了6倍，說明5-ALA的添加有利于血紅素的合成。

圖4 重組大腸桿菌胞內血紅素含量Fig.4 Intracellular heme concentration in recombinant E.coli

2.4 RhDypB的光譜分析

重組血紅蛋白的血紅素和蛋白質含量分別在408 nm(Soret峰)和280 nm處表示[6]。此外，Rz(Reinheit Zahl)值確定為A408/A280值[3]，以進一步表征血紅素在重組RhDypB中的摻入。將純化后的RhDypB進行光譜掃描，結果如圖5所示，所有重組RhDypB均在A408處顯示1個Soret峰，說明均有一定的血紅素摻入到RhDypB中。單獨表達的RhDypB菌株Rz值為0.15，pHemA-DyPB共表達重組菌株的Rz值約為0.31，可知將hemA與RhDypB共表達加強了血紅素與RhDypB的結合。此外，添加5-ALA后Rz值提高至0.37，根據圖4的結果，說明5-ALA的添加增加了血紅素的濃度，從而使RhDypB與血紅素結合度增加，與文獻[15]報道結果一致。

圖5 RhDypB的吸收光譜Fig.5 UV-Vis spectrum of recombinant RhDypB

2.5 RhDypB的過氧化物酶活性測定

RhDypB酶活性測定結果如圖6所示，共表達hemA后的菌株酶活性為3.24 U/mg，與pDypB菌株(1.68 U/mg)相比約提高了93%，pHemA-DypB菌株酶活性的提高可能是由于hemA基因的過表達，增加了血紅素與酶的結合度，繼而增加了酶對ABTS的氧化活性。與文獻[16]共表達血紅素合成途徑中的2個基因hemA與hemL相比，本研究共表達hemA基因后達到了相同的效果，即酶活性均得到約2倍的提高。添加5-ALA的菌株顯示出最高的過氧化物酶活性為3.40 U/mg，與pDypB菌株(1.68 U/mg)相比提高了約102%，說明5-ALA的添加促進了血紅素的合成，使RhDypB能夠結合更多血紅素形成全酶的形式，從而提高了酶活性。

圖6 不同重組菌株的RhDypB酶活性Fig.6 RhDypB enzyme activity of different recombinant strains

2.6 RhDypB對RB19脫色率測定

為了更好的表征過氧化物酶的活性，本研究測定了RhDypB對RB19的脫色情況，結果如圖7所示，RhDypB處理24 h后能有效的降解RB19，添加5-ALA 以及共表達hemA的菌株的脫色效果相近，曲線幾乎重合，脫色率分別為53%、51%，約是pDypB菌株(25%)的2倍。脫色效率與酶活性高低呈正相關，與RAMZI等[16]的研究結果一致。

a-吸收光譜；b-脫色率圖7 RhDypB對染料RB19脫色的吸收光譜與脫色率Fig.7 Spectrum of RB19 absorption and decolorization rate by RhDypB

3 結論

目前DyP已經在染料脫色以及木質素降解方面展現出良好的潛力[9, 19-21]。酶活性的高低仍然是后續工業生產中一個重要因素。在本研究中，將來自紅球菌的DypB成功地在大腸桿菌中表達，并且通過共表達血紅素合成途徑關鍵基因hemA，以及外源添加5-ALA的方式均使酶活有所提高，且利用共表達的方式與外源添加5-ALA效果相近，考慮到成本問題，利用代謝工程策略在生產應用中更經濟有效，同時在處理蒽醌染料RB19時，脫色率達到了53%，揭示了代謝工程策略的可行性，為今后酶的催化活性以及生產應用的研究奠定了一定的基礎。