4-甲基愈創木酚對酒精性肝損傷小鼠的保護作用

張瞭飛，姜欣，李一澍，陳杉彬，李紅嬌，趙文梅,3，韓興林，孫金沅，王德良*，郝飛克*

1(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)2(中國食品發酵工業研究院，北京，100015)3(廣西大學 生命科學與技術學院，廣西 南寧，530004)4(北京工商大學，食品質量與安全北京實驗室，北京，100048)

酒是各種應酬中必不可少的飲品，但長期大量飲酒會引起酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化及肝硬化等不同程度的肝損傷[1]。酒精性肝病受損的主要發病機制之一是氧化應激[2]，酒精進入機體被吸收并過量代謝，使肝細胞產生大量的氧自由基和代謝產物，影響肝臟正常的氧化還原反應，引起脂質過氧化并損害細胞膜通透性，進而損害肝細胞的完整性和功能，破壞細胞器，降低細胞器的修復能力，最終導致肝損傷[3-6]。多酚類化合物廣泛存在于植物體內，是一類具有1個或多個酚羥基的化合物[7]。人體自身不能合成多酚類化合物，因此需要從食物中攝取。研究表明多酚類化合物不僅具有較強的抗氧化作用，還具有抗腫瘤、保護肝臟、抗感染、增強免疫力、降低膽固醇及預防心血管疾病等功能[8]。4-甲基愈創木酚是一種天然存在于咖啡、可可、啤酒、雪利酒、威士忌酒中的多酚類化合物，具有辛香、藥香、丁香、香莢蘭香氣，多用于調配食用香精，也可用于威士忌的增香劑。近年來研究表明，在中國白酒中也可檢測到4-甲基愈創木酚[9]，并發現其具有抗氧化的生物活性[10]。有研究報道，其他多酚類物質，諸如茶多酚、姜黃素、槲皮素等對小鼠酒精性肝損傷有保護作用[11-13]，但尚未見4-甲基愈創木酚對酒精性肝損傷有保護作用。本研究旨在通過4-甲基愈創木酚對酒精性小鼠肝組織病理損傷的影響，觀察其對酒精性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及環境

C57BL/6J小鼠(雄性，49～56日齡，體重18～22 g)，斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2019—0010，飼養于(22±2) ℃、相對濕度(55±5)%的清潔級動物房，合籠飼養，5只/籠，控制照明時間為每天12 h，自由進食與飲水。實驗的相關操作嚴格遵守實驗動物福利倫理與保護相關規定，隨時接受實驗動物倫理委員會的監督與檢查。

1.2 藥品與試劑

4-甲基愈創木酚(分析純，純度>95%)，吉爾生化(上海)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號 PC0020)，北京索萊寶科技有限公司；總膽固醇(total cholesterol，TC)測定試劑盒(COD-PAP法)(貨號 A111-2-1)、甘油三酯(triglyceride，TG)測定試劑盒(GPO-PAP酶法)(貨號 A110-2-1)、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)測定試劑盒(貨號 A112-2-1)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)測定試劑盒(貨號 A113-2-1)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)測定試劑盒(貨號 C009-1-1)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)測定試劑盒(貨號 C010-1-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(批號A001-1-2)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)測定試劑盒(貨號 A006-1-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測定試劑盒(貨號 A005-1-2)、過氧化氫酶(catalase，CAT)測定試劑盒(貨號A007-1-1)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(貨號 A003-1-2),南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設備

LDZX-50KBS高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SpectraMax? iD3多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司；Micro 21R小型臺式離心機，美國Thermo公司；2-16 N高速微量離心機，湖南恒諾儀器設備有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠肝損傷模型的建立與實驗設計

50只小鼠適應喂養1周后，隨機分為5組，分別為空白組，模型組，4-甲基愈創木酚低、中、高劑量組，每組10只。除空白組小鼠灌胃0.9%的生理鹽水，模型組灌胃50%食用酒精外，其余各組小鼠均進行損傷和給藥處理，具體處理方式如表1所示，連續灌胃56 d。每周記錄小鼠體重變化，末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h后內眥取血，麻醉處死小鼠。迅速取出肝臟并稱重，計算肝臟指數(肝臟質量/體質量×100%)；同時取部分肝臟組織，4%中性甲醛固定制備石蠟切片，肝臟組織病理學變化采用蘇木精-伊紅染色后觀察；其余肝臟于-80 ℃低溫冰箱保存備用。

表1 各組小鼠實驗處理Table 1 Treatment of mice in each group

1.4.2 小鼠肝臟指數及肝功能檢測

末次給藥后，小鼠內眥取血，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，分離得到血清。采用賴氏法檢測血清轉氨酶AST和ALT水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 小鼠血脂水平檢測(TC/TG/HDL-C/LDL-C)

采用COD-PAP法檢測血清中TC水平，采用GPO-PAP酶法檢測血清中TG水平，采用直接法檢測血清中HDL-C和LDL-C水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.4 小鼠肝臟中抗氧化酶活性和GSH含量的檢測

采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD的活力，采用鉬酸銨法測定CAT的活力，采用比色法測定GSH-Px活力、GSH含量，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.5 小鼠肝臟中過氧化產物MDA含量的檢測

采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)測定MDA的含量，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.6 小鼠肝臟組織病理學檢查

肝臟組織用4%中性多聚甲醛固定24 h后轉入70%酒精溶液中脫水24 h，然后常規石蠟包埋后制作厚度約4～5 μm的切片。用二甲苯脫蠟制備好的切片，酒精梯度(95%、90%、80%、75%)脫水；蘇木精染色；鹽酸乙醇分化；0.5%伊紅染色；常規梯度酒精(75%、80%、90%、95%)脫水；經100%酒精I(10 min)，100%酒精Ⅱ(10 min)；最后經二甲苯透明后中性樹膠封片，在Olympus光學顯微鏡下，選取不同的視野拍照并分析肝臟組織病理學變化。

1.4.7 數據分析

本實驗采用SPSS 25.0分析處理數據，所有實驗數據為至少3個平行試驗的平均值，用平均值±標準誤表示；圖表由Origin 2017繪制，P<0.05時表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 4-甲基愈創木酚對小鼠體質量及肝臟指數的影響

實驗期間，各組小鼠體質量增長正常。小鼠體質量和肝臟指數如表2所示，與正常對照組相比，模型組的小鼠體質量明顯減輕(P<0.05)，但肝臟質量和肝臟指數明顯増加(P<0.05)。4-甲基愈創木酚干預可明顯降低小鼠的肝臟指數，與模型組相比，4-甲基愈創木酚各劑量組小鼠的肝臟指數分別降低了7.3%(P<0.05)、12.7%和14.5%(P<0.05)。

表2 各組小鼠體質量與肝臟指數Table 2 Body weight and liver index of mice in each group

2.2 4-甲基愈創木酚對小鼠肝臟功能的影響

如圖1所示，與空白組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT水平明顯升高 (P<0.05)，分別是空白組的1.15、1.25倍;與模型組比較，4-甲基愈創木酚低、中劑量組小鼠血清中的AST水平降低，但無顯著性差異，而高劑量組小鼠血清中AST水平降低了22% (P<0.05)；與模型組比較，4-甲基愈創木酚低劑量組小鼠血清中的ALT水平降低，但無顯著性差異，而中、高劑量組小鼠血清中ALT水平分別降低了17%和37%，且具有統計學差異 (P<0.05)。AST、ALT是臨床上常用的肝功能評價指標，它們水平的高低可以反應肝細胞所受損傷程度的輕重，AST主要存在于肝細胞線粒體中，ALT主要存在于肝細胞的胞漿內，肝細胞受損時，這2種酶可釋放到血液中，引起血液中肝功能酶學指標異常升高[14-15]。肝臟是酒精代謝的主要場所，而代謝過程中的活性氧和有毒產物會破壞肝細胞膜和線粒體膜，導致這2種膜的通透性增加，轉氨酶AST、ALT便釋放入血[16]。上面的實驗結果顯示，模型組小鼠血清中AST、ALT水平均明顯升高，表明小鼠酒精性肝損傷模型建立成功。4-甲基愈創木酚高劑量組可明顯降低小鼠血清中AST的水平，4-甲基愈創木酚中、高劑量組可明顯降低小鼠血清中的ALT水平，表明4-甲基愈創木酚高劑量可有效保護肝細胞膜和線粒體膜，維持肝功能正常。

圖1 4-甲基愈創木酚對小鼠血清中AST、ALT活性的影響Fig.1 Effect of 4-methyl guaiacol on serum AST,ALT activity in mice注：*代表與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)；#代表與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 4-甲基愈創木酚對小鼠血脂水平的影響

如圖2所示，與空白組比較，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平明顯升高 (P<0.05)，分別是空白組的1.19、1.16、1.54倍，而HDL-C水平明顯下降(P<0.05)，比空白組降低了13.5%(P<0.05);與模型組比較，4-甲基愈創木酚低、中、高劑量組小鼠血清中TC水平分別降低了17.5%、20.1%和25.6% ；TG水平分別降低了14.9%、43.7%和63.1% ；LDL-C水平分別降低了57.4%、52.9%和18.3%；HDL-C水平分別升高了26.5%、30.9%和73.5%，且具有統計學差異(P<0.05)。脂質代謝紊亂是酒精性肝損傷的另一重要表現，主要表現為肝細胞內TG的沉積，同時酒精影響了肝臟脂質代謝和血清脂質的轉運導致出現血脂水平異常[17]。LDL-C和HDL-C是在體內轉運血脂的2種載脂蛋白，其中LDL-C的功能是轉運內源性膽固醇，是將脂類由肝臟向外周轉運，HDL-C的功能是逆向轉運膽固醇，是將脂類由外周轉運至肝臟分解代謝[18]。LDL-C增高則會引起血漿TC和TG增高，形成高血脂，酒精肝損傷會導致脂質代謝紊亂，TC、TG代謝受到抑制，脂肪在肝細胞中過多沉積的同時，肝臟代償功能喪失，體內存儲的大量脂肪被動轉移，導致血清中TG水平明顯升高[19]。已有的研究表明，動物攝入酒精后，血清中的TC、TG水平均升高，且血清LDL-C水平升高而HDL-C水平降低[20]。研究結果顯示，小鼠攝入酒精后可導致機體脂質代謝紊亂，血清的TC、TG和LDL-C水平升高，而血清HDL-C水平降低，4-甲基愈創木酚干預可明顯減輕酒精性肝損傷所致的血脂水平異常。

a-TC；b-TG；c-LDL-C；d-HDL-C圖2 4-甲基愈創木酚對小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量的影響Fig.2 Effect of 4-methyl guaiacol on serum TC，TG，LDL-C,HDL-C content in mice

2.4 4-甲基愈創木酚對小鼠抗氧化酶活性和還原型谷胱甘肽含量的影響

由圖3可如，模型組小鼠肝臟組織勻漿中SOD、CAT、GSH、GSH-Px活力均下降，且與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，說明酒精誘導的氧化損傷降低了小鼠體內SOD、CAT、GSH、GSH-Px的活力。4-甲基愈創木酚各劑量組小鼠肝臟組織勻漿中SOD活力均高于模型對照組，且低、中、高劑量組實驗小鼠肝臟組織勻漿中SOD活力與空白組比較，無顯著性差異，說明4-甲基愈創木酚起到維持肝臟中SOD活力穩定的作用。4-甲基愈創木酚各劑量組小鼠肝臟組織勻漿中CAT活力均高于模型組，且與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，其中高劑量組實驗小鼠肝臟組織勻漿中CAT活力與空白組基本一致。GSH-Px、GSH活力均高于空白組和模型組，且差異有統計學意義(P<0.05)。SOD、CAT、GSH、GSH-Px均屬正常機體的抗氧化系統，它們共同維持機體氧化平衡[21]。已有的研究表明，肝損傷會導致肝臟中的SOD、CAT、GSH、GSH-Px水平降低[22]，本實驗建立的酒精性肝損傷模型顯示與其基本一致。小鼠酒精灌胃后，4-甲基愈創木酚干預后，各劑量組肝臟中的SOD、CAT、GSH、GSH-Px水平升高或與正常狀態保持一致，說明4-甲基愈創木酚可提高機體抗氧化酶活性，改善酒精性肝損傷。

a-SOD；b-CAT；c-GSH-Px；d-GSH圖3 4-甲基愈創木酚對小鼠肝臟中SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性的影響Fig.3 Effect of 4-methyl guaiacol on SOD,CAT,GSH-Px,GSH activity in mouse liver

2.5 4-甲基愈創木酚對小鼠過氧化產物的影響

由圖4可知，模型組小鼠與空白對照組比較，肝組織中過氧化物指標MDA升高，差異性具有統計學意義(P<0.05)，提示酒精氧化損傷模型建立成功。4-甲基愈創木酚各劑量組小鼠與模型組比較，MDA濃度均有不同程度降低，均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。MDA是脂質過氧化反應的小分子產物之一，其含量的高低反映了細胞脂質過氧化程度，因此常被作為生物脂質過氧化反應的檢測指標。已有的研究表明，酒精性肝損傷小鼠肝臟中過氧化產物MDA含量大量增加，我們的研究與其基本一致，小鼠灌胃酒精后，在4-甲基愈創木酚的干預下肝臟中MDA含量明顯減少，說明4-甲基愈創木酚可減輕肝臟由酒精導致的脂質過氧化反應[23]。

圖4 4-甲基愈創木酚對小鼠肝臟中MDA含量的影響Fig.4 Effect of 4-methyl guaiacol on MDA content in mouse liver

2.6 4-甲基愈創木酚對小鼠肝組織病理形態的影響

如圖5所示，空白組顯示肝組織結構正常，肝細胞排列整齊、結構清晰，無水腫現象及炎性細胞；模型組小鼠肝組織結構、肝細胞排列紊亂，大多數肝細胞呈水腫現象，炎癥細胞浸潤，肝細胞纖維化，肝組織中有大小不一的脂肪滴空泡；4-甲基愈創木酚低、中劑量組小鼠肝組織結構、肝細胞排列較整齊，肝細胞水腫現象、肝組織內炎性細胞、脂肪滴空泡較模型組有所減輕；4-甲基愈創木酚高劑量組小鼠肝組織結構清晰，肝細胞排列整齊、大小均一，炎性細胞、脂肪滴空泡較模型組顯著減輕。酒精性肝損傷的組織學特征主要包括肝細胞脂肪滴空泡的積累、脂肪肝 (脂肪變性和炎性細胞) 及肝硬化[24]。通過蘇木精-伊紅染色發現，本實驗模型組小鼠的肝組織發現有大量炎性細胞和脂肪滴空泡，4-甲基愈創木酚給藥后此現象顯著減輕，說明4-甲基愈創木酚可能對肝臟具有保護作用。

a-空白組；b-模型組;c～e-4-甲基愈創木酚低、中、高劑量組圖5 各組小鼠肝組織病理形態Fig.5 Hepatic histological morphology of mice in each group

3 結論

本實驗采用50%食用酒精對小鼠進行灌胃，成功建立酒精性肝損傷的模型， 4-甲基愈創木酚給藥后小鼠血清中AST和ALT活性降低，小鼠肝臟中SOD、CAT、GSH-Px和 GSH 的活性明顯強于模型組，或與正常小鼠一致，MDA 水平低于模型組，說明4-甲基愈創木酚可以保護肝臟中的抗氧化酶活性，并減少脂質過氧化物MDA的產生，進而保護肝臟，并減輕酒精性肝臟損傷。通過蘇木精-伊紅染色發現，4-甲基愈創木酚給藥后酒精性肝損傷病理特征顯著減輕。綜上所述，4-甲基愈創木酚對肝臟具有保護作用，可以在一定程度上減輕酒精對肝臟所造成的損傷，其機制可能與增加肝組織抗氧化酶的活性、降低脂質過氧化水平有關。