羥自由基氧化對核桃蛋白性質和結構的影響

張雪春,李如蕊，程群,楊曦,王嬌芳,劉江,孫健

1(西南林業大學 生命科學學院，云南 昆明，650224)2(廣西農業科學院 農產品加工研究所，廣西 南寧，530007)

核桃是世界上主要堅果之一，其仁中含有55%～70%的油脂，18%～24%的蛋白質，并富含礦物質、維生素和天然抗氧化劑[1]。核桃蛋白中8種必需氨基酸比例合理，接近WHO和FAO的推薦范圍，是具有較大發展潛力的植物蛋白。

研究發現，光、過渡金屬、自由基等物理化學因素可使蛋白質氧化，其主鏈和氨基酸殘基的側鏈發生變化，進而使蛋白質的感官、功能性質、消化率和營養品質降低[2]。蛋白質經氧化后羰基化合物含量增加[3]，蛋白的分子間作用力被破壞，高級結構改變并形成交聯聚集[4-6]，因此通過研究蛋白質的理化性質、光譜特征、反應位點等可反映氧化對蛋白質的作用規律。據文獻報道，羥自由基氧化可導致豬肉、魚肉的凝膠化改變，持水能力下降[7]；其中，胱氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸等氨基酸較易被氧化[8-9]；羥自由基氧化在一定程度上可提高大豆蛋白和卵清蛋白的界面性質[10-11]，因此對改善富含蛋白質食品的穩定性有研究意義，但嚴重的氧化則會導致相反的結果，而一些植物提取物可起到抑制羥自由基氧化食物蛋白質的作用[2，12]。此外，相關研究也證實，一些植物和動物蛋白經氧化后，構象和相關性質均發生了相應的改變[13-14]。

目前，蛋白質的氧化研究主要集中于動物蛋白的貯藏和加工等方面，關于羥自由基氧化對核桃等植物蛋白的結構、性質、生理活性等方面的研究還不夠全面和深入，而對蛋白質氧化的基礎研究對于探明食物蛋白質在貯藏、加工、消化等階段中的變化規律具有一定意義。因此，本文以核桃蛋白為研究對象，經鐵/過氧化氫/抗壞血酸(Fe/H2O2/Asc)體系產生羥自由基，研究氧化修飾對核桃蛋白的主要基團、性質和微觀結構等的影響規律，為核桃蛋白的基礎研究和開發利用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

核桃餅粕，大理州巍山縣大倉鎮大理鑫淼農業實業有限公司；福林酚試劑盒、2，4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)、二硫代二硝基苯甲酸[5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、牛血清白蛋白等，北京索萊寶科技有限公司；三氯化鐵、抗壞血酸等，均為分析純試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Nano-ZS納米激光粒度儀，英國Malvem公司；S-3000 N掃描電子顯微鏡，日本HITACHI公司；3K15型高速冷凍離心機，美國Sigma 公司；FJ200-SH型數顯高速分散均質機，上海標本模型廠；UV-1000紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科技儀器有限公司；F50型酶標儀，北京市永光明醫療儀器有限公司；Lumina熒光分光光度計，美國賽默飛世爾科技公司；4.5 L真空冷凍干燥機，美國LABCONCO公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 核桃蛋白的制備

核桃餅粕經去雜、粉碎過60目篩后，加入25倍水調pH至8.7，于48 ℃攪拌提取1 h后，4 000 r/min離心20 min，取上清液調pH至5，于相同條件下離心，取沉淀水洗至中性，凍干為核桃蛋白(walnut protein, WP)。

1.3.2 羥自由基氧化核桃蛋白的制備

參照KONG等[15]方法并略做修改。控制FeCl3和抗壞血酸的濃度分別為0.01 mmol/L和0.1 mmol/L，分別調節H2O2濃度至0、0.1、1、5、10、15 mmol/L，核桃蛋白于上述氧化體系中4 ℃反應24 h后，經乙二胺四乙酸終止得到羥自由基氧化核桃蛋白(hydroxyl radical oxidized walnut protein, HRO-WP)。

1.3.3 羰基含量的測定

參照WANG等[16]方法并略做修改，采用DNPH顯色法測定HRO-WP中羰基含量。HRO-WP與DNPH反應后，經三氯乙酸沉淀，鹽酸胍溶解后，于370 nm測定吸光度值，采用22 000 L/(mol·cm)摩爾消光系數換算，羰基含量表示為nmol/mg蛋白。

1.3.4 游離巰基與總巰基的測定

參照KONG等[15]方法，采用DTNB顯色法測定HRO-WP中總巰基與游離巰基的含量。HRO-WP與DTNB水浴反應1 h后，離心取上清液于412 nm處測定吸光度值，采用13 600 L/(mol·cm)摩爾消光系數換算，游離巰基含量表示為nmol/mg蛋白。

HRO-WP經β-巰基乙醇和尿素-鹽酸胍處理后，按上述方法測定和計算HRO-WP的總巰基含量。

1.3.5 內源熒光光譜分析

參考ZHANG等[17]的方法并略做修改。配制1 mg/mL HRO-WP磷酸鹽緩沖液，經充分攪拌均勻后，于4 ℃，10 000 r/min離心30 min，取上清液以290 nm為激發波長，發射波長為300～500 nm熒光掃描。

1.3.6 HRO-WP粒徑分布的測定

HRO-WP經磷酸鹽緩沖液稀釋為1 mg/mL后，采用激光納米粒度分析儀測定其粒徑分布情況。

1.3.7 溶解度的測定

參考ZHANG等[18]的方法并略做修改。HRO-WP經0.05 mol/L pH 7.9磷酸鹽緩沖液配制為1 mg/mL溶液，于8 000 r/min離心15 min，分別測定上清液和核桃蛋白樣品中的蛋白質含量。核桃蛋白的溶解度按公式(1)計算：

(1)

1.3.8 持水性和持油性的測定

參考孫英杰[19]的方法并略做修改。取0.4 g的HRO-WP和8 mL的水于離心管中渦漩振蕩1 min后，于3 000 r/min離心20 min，傾出上清液，稱量離心管中核桃蛋白和殘留水的質量，持水性表示為單位質量核桃蛋白可結合水的質量(g/g)。把水換成大豆油，以類似的方法測定和計算HRO-WP的持油性，持油性表示為單位質量核桃蛋白可結合油的質量(g/g)。

1.3.9 乳化性和乳化穩定性的測定

參考盧巖[10]的方法并略修改，大豆油與1 mg/mL HRO-WP磷酸鹽緩沖溶液按體積比1∶4混合后，于10 000 r/min高速分散1 min，立即從底部吸取50 μL乳狀液與25 mL的0.1%(質量分數)SDS溶液混勻，于500 nm處測定吸光度值A0，靜置10 min后再測定吸光度值A10，按公式(2)和公式(3)計算HRO-WP的乳化性(emulsifying activity index，EAI)和乳化穩定性(emulsifying stability index，ESI)：

(2)

(3)

式中：N，稀釋因子，500；c，核桃蛋白溶液的質量濃度，mg/mL；t，時間間隔，10 min；φ，乳狀液中油相的體積分數，0.25。

1.3.10 起泡性和起泡穩定性的測定

參考LI等[11]的測定方法并略做修改。HRO-WP經pH 7磷酸鹽緩沖液配制為1 mg/mL溶液，于室溫攪拌1 h，取20 mL于10 000 r/min高速分散2 min，分別測定0 min和30 min時總體積，按公式(4)、公式(5)計算起泡性(foaming capacity, FC)和起泡穩定性(foaming stability, FS)：

(4)

(5)

1.3.11 電鏡掃描分析

取少量HRO-WP樣品粘貼在掃描電鏡樣品臺上，以無水乙醇潤濕并分散均勻，干燥后經噴金處理，采用500倍放大掃描觀察其微觀形貌。

1.3.12 數據處理與分析

所有試驗操作均重復3次，試驗數據采用Microsoft Excel 2010和Origin 2018 32Bit處理分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 核桃蛋白羰基含量的變化情況

羥自由基氧化蛋白的過程復雜并伴隨著許多相應產物的產生，其中羰基是應用最廣泛的初步評價蛋白氧化程度的指標，羥自由基對核桃蛋白羰基含量的影響如圖1所示，隨著氧化程度的增大，核桃蛋白的羰基含量呈濃度依賴性增加，當H2O2濃度為15 mmol/L時，羰基含量相比對照組顯著增加88.94%(P<0.05)。與楊曦等[20]的研究結果相似，說明在氧化體系中，羥自由基攻擊核桃蛋白的主肽鏈或側鏈，形成碳中心自由基，進而生成醛類和酮類等羰基衍生物[21-22]。

圖1 HRO對核桃蛋白羰基含量影響Fig.1 Effect of HRO on the carbonyl content of WP注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 核桃蛋白游離巰基和總巰基的變化情況

蛋白質氧化首先導致巰基和蛋氨酸殘基的修飾，因此核桃蛋白氧化后的結構變化可通過總巰基和游離巰基的含量反映。羥自由基氧化體系對核桃蛋白的總巰基和游離巰基的影響如圖2所示。隨著H2O2濃度的逐漸增大，核桃蛋白的總巰基和游離巰基呈顯著下降趨勢(P<0.05)，當H2O2濃度為15 mmol/L時，與對照組相比，總巰基和游離巰基含量分別下降28.2%和27.5%，表明核桃蛋白經羥自由基氧化后，可能會發生可逆的氧化反應，使巰基被氧化為二硫鍵和次磺酸狀態，同時也可能發生不可逆的氧化，導致核桃蛋白游離巰基和總巰基的下降，這與盧巖[10]對大豆蛋白進行氧化后研究結果相似。

圖2 HRO對核桃蛋白游離巰基和總巰基的影響Fig.2 Effect of HRO on free and total sulfydryl of WP

2.3 內源熒光的變化情況

蛋白質內源熒光的產生是由于色氨酸殘基的存在，其相對位置可通過熒光峰位來反映，常用來表征蛋白質構象的變化。羥自由基對可溶性核桃蛋白內源熒光強度和熒光最大發射波長的影響如圖3和圖4所示。隨著H2O2濃度的增大，可溶性核桃蛋白的熒光強度逐漸減小，在H2O2濃度為15 mmol/L時，熒光強度下降34.8%。這可能是由于羥自由基使可溶性核桃蛋白的三級結構展開，色氨酸殘基被氧化為犬尿氨酸，從核桃蛋白分子的外部遷移至內部，從而降低其內源熒光強度。此外，經羥自由基氧化后，可溶性核桃蛋白的最大熒光峰位由原來的328.9 nm藍移到325.6 nm，這與李玲等[23]和LI等[24]的研究結果類似，說明經羥自由基氧化后，可溶性核桃蛋白的色氨酸殘基暴露于疏水環境中，且暴露出來的疏水基團通過相互作用形成聚集體[5]。

圖3 HRO對核桃蛋白內源熒光強度的影響Fig.3 Effect of HRO on endogenous fluorescence intensity of WP

圖4 HRO對核桃蛋白最大發射波長的影響Fig.4 Effect of HRO on maximum emission wavelength of WP

2.4 核桃蛋白平均粒徑的變化情況

動態光散射可監測蛋白質的聚集情況。羥自由基氧化修飾對核桃蛋白平均粒徑的影響如圖5所示。隨著H2O2濃度的增大，核桃蛋白的平均粒徑逐漸增加，當H2O2濃度為15 mmol/L時，核桃蛋白的平均粒徑增大12.7%。可能是羥自由基氧化使核桃蛋白分子的疏水基團暴露，在二硫鍵和次級鍵的作用下空間結構發生交聯，生成較大的蛋白質聚集體，表現為核桃蛋白的平均粒徑增大。本研究的結果與王耀松等[25]的研究結果類似。

圖5 HRO對核桃蛋白平均粒徑的影響Fig.5 Effect of HRO on mean particle size of WP

2.5 核桃蛋白功能性質的變化情況

羥自由基對核桃蛋白溶解度、持水性、持油性、起泡性質和乳化性質的影響如表1所示。核桃蛋白的溶解性與其粒徑大小有一定關系，可用于表征蛋白質交聯及聚集的程度。因此溶解度也可作為核桃蛋白氧化程度的一個指標。隨著H2O2濃度的增加，核桃蛋白的溶解度呈下降趨勢，在H2O2濃度為15 mmol/L時最小，相比對照組下降了45.6%。這可能是在羥自由基的氧化作用下，核桃蛋白的構象被破壞，一些疏水基團暴露，進一步發生聚合形成不可溶性大分子聚集體[26]，該結果也驗證了本研究中核桃蛋白平均粒徑隨氧化濃度增大的結果。

如表1所示，羥自由基氧化可不同程度地增大核桃蛋白的持水性和持油性。其中持水性在H2O2濃度為15 mmol/L時最大，相比對照組增大136.6%；持油性在H2O2濃度為0.1 mmol/L時最大，相比對照組增大146.0%。可能是因為氧化使核桃蛋白一部分疏水基團顯露，且巰基被氧化成二硫鍵發生交聯，形成大分子蛋白聚集體，導致核桃蛋白的組織結構發生改變，與水或油的接觸面積增加，能夠吸收更多的水或油。此外，持水性和持油性還與核桃蛋白分子的聚集情況有關。這與大豆蛋白經氧化后持水性和持油性增大的結果相似[27]。

表1 HRO對核桃蛋白加工性質的影響Table 1 Effect of HRO on functional properties of WP

從表1可知，隨著H2O2濃度的逐漸增大，核桃蛋白的EAI和ESI呈先上升后下降的趨勢。EAI和ESI分別在H2O2濃度為10 mmol/L和1 mmol/L時最大，增幅分別為108.8%和53.4%，這是因為核桃蛋白的粒徑、溶解度、分子柔性等方面均可影響其乳化性能。經低濃度H2O2氧化后，核桃蛋白結構被破壞，導致其內部疏水基團暴露，且氧化提高了核桃蛋白的分子柔韌性，更容易結合到油-水界面，形成更穩定的蛋白膜。這與盧巖[10]報道的適度氧化可增加大豆蛋白乳液穩定性的結果類似。而當氧化程度較高時(>10 mmol/L)，由于核桃蛋白的聚集、絮凝等作用，使其溶解性和分子柔性變小，從而表現為乳化性能的降低。

如表1所示，核桃蛋白經羥自由基氧化后，起泡性呈先上升后下降的趨勢，在H2O2濃度為1 mmol/L時最大，相比對照樣增大42.6%。這是因為在羥自由基氧化過程中，適宜的H2O2濃度可使維持核桃蛋白結構的非共價鍵展開，導致核桃蛋白的柔韌性增強，從而可更快地吸附聚合更多蛋白，同時核桃蛋白分子間相互作用逐漸變強，形成相對穩定的核桃蛋白分子結構和界面膜；而當過度氧化時，核桃蛋白分子內部結構充分展開，疏水基團暴露到一定程度則導致其起泡能力的下降。該結果與LI等[11]和孫領鴿等[27]的研究結果類似。

2.6 核桃蛋白微觀形貌的變化情況

核桃蛋白經羥自由基氧化的電鏡掃描結果如圖6所示。相比對照樣，經0.1 mmol/L H2O2氧化后，核桃蛋白分子聚集變得更緊實；而當H2O2濃度為15 mmol/L時，核桃蛋白分子聚集為較大尺寸的形狀，表面孔隙率增加且分布不均勻，呈現類似于“蜂窩”的結構。可能是H2O2氧化使核桃蛋白分子的內部構象伸展，巰基和疏水基團暴露，并發生相互作用，從而改變核桃蛋白分子的聚集情況。這與核桃蛋白經氧化后的粒度增大和溶解度降低的結果相對應。同時，豬肉肌原纖維蛋白經氧化后的微觀形貌也顯示相似的結果[28]。

a-對照；b-0.1 mmol/L H2O2；c-15 mmol/L H2O2圖6 核桃蛋白的掃描電鏡圖Fig.6 SEM of walnut protein

3 結論

本研究通過建立羥自由基氧化體系，分析其對核桃蛋白的結構和功能性質的影響。隨著氧化體系中H2O2濃度的增加，核桃蛋白的總巰基、游離巰基、溶解性和內源熒光強度呈逐漸降低的趨勢；羰基、平均粒徑、起泡穩定性和持水性呈逐漸上升的趨勢；乳化性、乳化穩定性、起泡性和持油性呈先上升后下降的趨勢；核桃蛋白經羥自由基氧化后的微觀結構呈聚集狀態，孔隙率提高。羥自由基氧化對核桃蛋白的結構和功能性質有較大影響，適度氧化可改善其乳化性能和起泡性能。