阿魏側耳胞外多糖分離純化及其免疫活性研究

王晶，喬潔，裴新云，常世民，劉學娟,3，閆訓友

1(廊坊師范學院 生命科學學院，河北 廊坊，065000)2(河北省食藥用菌資源高值利用技術創新中心，河北 廊坊，065000)3(廊坊市細胞工程與應用研究重點實驗室，河北 廊坊，065000)

多糖，又稱為聚糖，一般指由10個以上單糖通過糖苷鍵連接而成高分子化合物[1]。多糖在自然界中分布廣泛，在真菌細胞壁中約占90 %[2]，具有免疫調節[3]、調節腸道菌群[4]、降血糖[5-6]、降血脂[5]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8]和保濕[9]等多種生物學功能。多糖分為胞內多糖、胞壁多糖和胞外多糖3種[10]，與胞內多糖不同，真菌胞外多糖易與菌體分離，可通過液體發酵獲得，具有生產周期短、成本低和易于控制等優勢[11]。

阿魏側耳(P.ferulaeLanzi)，是一種食藥兼用的擔子菌，具有抗腫瘤、提高免疫力[12]和抗氧化等功效[13]。阿魏側耳胞外多糖是從液體發酵液中提取的多糖組分[14]，相關研究目前集中在液體發酵[14-15]、粗多糖提取[10]及粗多糖的生物活性探索等[10, 16-17]，未有純化組分對體外培養的巨噬細胞和淋巴細胞免疫調節作用的相關報道。本文對阿魏側耳發酵液中的胞外粗多糖進行了分離純化，初步研究了阿魏側耳胞外多糖水提組分的性質及其對體外培養的巨噬細胞和淋巴細胞免疫能力的調節作用，為其開發利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

阿魏側耳菌種，中國科學院菌種保藏中心;ICR 小鼠，斯貝福(北京)生物技術有限公司(許可證號SCXK(京)2016—0002)，雄性，5～6 周齡，體重25 g 左右(倫理審查批準號為LFNUSKYLL2020001)；DEAE-52 纖維素，美國Bio-Rad公司；Sephadex G-100葡聚糖凝膠，GE醫療集團生命科學部；F12K培養基，美國Sigma公司；優級胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，浙江天杭生物科技股份有限公司；白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒，青島海德誠生物工程有限公司；NO熒光探針(4-amino-5-methylamino-2′, 7′-difluorofluorescein diacetate，DAF-FM DA)和活性氧熒光探針(2′, 7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，北京碧云天生物技術有限公司；小鼠脾臟淋巴細胞分離液、葡聚糖標準品(Dextran T-10，Dextran T-40，Dextran T-70，Dextran T-500)、MD44透析袋(截留分子質量8 kDa)，北京索萊寶科技有限公司；D-甘露糖(D-mannose, Man)、D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid, GlcA)、D-半乳糖醛酸(D-galacturonic acid monohydrate, GalA)、L-鼠李糖(L-rhamnose, Rha)、D-葡萄糖(D-glucose, Glc)、D-半乳糖(D-galactose, Gal)、L-阿拉伯糖(L-arabinose, Ara)和L-巖藻糖(L-fucose, Fuc)，上海麥克林生化科技有限公司；24孔細胞培養板和離心管，美國Corning公司；實驗所需其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

1260 Infinity液相色譜儀(配有G1362A RID示差折光檢測器和DAD檢測器)、PL aquagel-OH MIXED-H 凝膠柱、Agilent ZORBAX SB-C18柱，美國Agilent科技公司；MCO-20AIC二氧化碳培養箱和MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司；UV-1801紫外/可見分光光度計，北京北分瑞利分析儀器有限責任公司；iMark酶標儀，美國Bio-Rad公司；Milli-Q超純水機，美國Millipore公司；Hei-VAp Advantage旋轉蒸發儀，德國Heidolph公司；CKX41SF倒置顯微鏡(配有CCD圖像傳感器DP71及Image-pro plus 圖像分析軟件)、IX71倒置熒光顯微鏡(配有CCD圖像傳感器DP73)，日本Olympus公司；ZHJH-C超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；ALPHA 1-2 冷凍干燥機，德國Martin Christ 公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋、SPX-250B-Z生化培養箱、BSD-YX 3600立式智能搖床，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；UNIC-7200型可見光分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阿魏側耳胞外粗多糖的提取

發酵培養。挑選生長狀態良好的阿魏側耳菌絲體，接種于已優化的液體發酵培養基中(培養基組成：透析袋透析后的馬鈴薯浸提液200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨4 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L)，25 ℃，150 r/min搖床培養10 d，培養結束后收集發酵液，銅網過濾，4 000 r/min離心20 min，收集上層液體，用旋轉蒸發儀60 ℃濃縮至原體積的1/10。

醇沉干燥。濃縮后的發酵液中加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃醇沉12 h，4 000 r/min離心20 min，收集沉淀，用75 %(體積分數)乙醇洗滌2次，離心，去上清液體，沉淀用丙酮洗滌2次，離心收集沉淀，冷凍干燥后備用。

復溶和除蛋白。將醇沉干燥后的阿魏側耳胞外多糖復溶于蒸餾水中，4 000 r/min離心20 min，收集上清液，轉入分液漏斗，加入1/5 體積的Sevag試劑(氯仿-正丁醇，體積比為4∶1)，振蕩30 min，靜置5 h，去除含白色凝膠物質的有機層；重復4～5次，直至有機層中無明顯白色為止。

透析。將除蛋白后的阿魏側耳胞外多糖溶液，分裝于透析袋(截留分子質量8 kDa)中，流水透析24 h，超純水4 ℃透析24 h，旋轉蒸發儀濃縮，冷凍干燥后備用。

1.2.2 阿魏側耳胞外多糖的分離純化

1.2.2.1 DEAE-52 纖維素柱層析

將處理后的 DEAE-52纖維素裝入層析柱(1 cm×20 cm)，調整流速為1 mL/min，超純水平衡 24 h。將冷凍干燥的阿魏側耳多糖復溶于超純水中(10 g/L)，4 000 r/min離心10 min，收集上清5 mL，上樣DEAE-52 纖維素柱，超純水洗脫，流速1 mL/min，自動分步收集器收集，苯酚-硫酸法[18]跟蹤檢測，繪制洗脫曲線并按峰收集，每管5 mL，將收集到的多糖溶液濃縮、冷凍干燥后備用。

1.2.2.2 Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析

將處理后的Sephadex G-100葡聚糖凝膠裝柱(2 cm×60 cm)，調整流速為0.5 mL/min，平衡和洗脫方法同上。將DEAE-52 纖維素柱層析分離的多糖復溶(濃度為10 g/L)，針頭濾器(孔徑為0.45 μm)抽濾后，上樣SephedexG-100葡聚糖凝膠柱，超純水洗脫，按照1.2.2.1方法繪制洗脫曲線、按峰收集。將收集的溶液濃縮、冷凍干燥后得到純化的阿魏側耳胞外多糖水提組分。

1.2.3 阿魏側耳胞外多糖的分子量測定

參照范三紅等[7]的高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography, HPGPC)，并適當改進。將葡聚糖標樣和多糖樣品用超純水溶解，濾器(孔徑為0.45 μm)抽濾。色譜條件：Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀，Agilent PL aquagel-OH MIXED-H 凝膠柱(7.5 mm×300 mm，8 μm)，檢測器為Agilent G1362A RID示差折光檢測器，柱溫35 ℃，進樣量20 μL，流動相：超純水，流速：0.6 mL/min；標準品為已知分子質量的葡聚糖(Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70和Dextran T-500)。將葡聚糖標準品配制成1.0 mg/mL的溶液，按上述條件測定各標準品和多糖樣品的保留時間，以葡聚糖標準品平均分子質量的對數值lgMw為因變量，保留時間t為自變量，進行相關回歸分析，得到一元線性回歸方程，根據回歸方程，計算多糖樣品的平均分子質量。

1.2.4 阿魏側耳胞外多糖的單糖組成分析

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)柱前衍生化單糖，高效液相色譜法分離鑒定[16]。在離心管中加入0.05 moL/L單糖混樣100 μL，0.5 mol/L PMP-甲醇溶液100 μL，0.3 mol/L NaOH 100 μL，渦旋混勻，70 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl 100 μL，混勻中和，加入蒸餾水1 mL，氯仿2 mL，充分混勻后靜置，棄下層有機相，重復萃取3次；濾器(孔徑為0.45 μm)抽濾后，轉入樣品瓶中待用，每個待測樣品3個重復。取阿魏側耳胞外多糖5 mg，置于安瓿瓶中，加入2 mol/L 三氟乙酸1 mL，酒精噴燈封口，110 ℃水解6 h，冷卻至室溫，加甲醇后真空干燥，重復操作多次，去除三氟乙酸，0.3 mol/L NaOH調中性，定容至1 mL。

HPLC條件：Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀，Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，檢測器為Agilent DAD檢測器，檢測波長為250 nm，柱溫35 ℃，上樣體積20 μL；流動相：A：0.02 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered solution，PBS)，pH 6.0；流動相B：乙腈，流速1.0 mL/min；洗脫梯度：0 min，0%B；10 min，18%B；20 min，25%B。

1.2.5 阿魏側耳胞外多糖水提組分的免疫細胞調節活性

1.2.5.1 細胞的收集和培養

巨噬細胞的收集采用灌洗腹腔法，參考王晶等[19]方法進行。將小鼠頸椎脫臼后，置75%(體積分數)乙醇中浸泡1 min，重復2次后轉入超凈工作臺，無菌注射F12K培養液至小鼠腹腔，收集含細胞的腹腔液至離心管中，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，細胞沉淀用含10 % FBS(F12K-FBS，體積比為9∶1)F12K培養液重懸后，均勻地接種到細胞培養板中，置37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱中培養。

淋巴細胞的收集采用密度梯度離心法，參照小鼠脾臟淋巴細胞分離液的操作說明進行。按上述方法處死小鼠，取脾臟置75%乙醇中浸泡1 min，PBS漂洗3次，轉至F12K培養液中；脾臟一端剪一小口，緩慢擠出細胞，銅網過濾，收集細胞懸液至離心管(預先加入適量淋巴細胞分離液)中，2 500 r/min離心20 min，吸取第二層的淋巴細胞懸液至離心管中，細胞洗滌液洗滌，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，重復1次，細胞用無血清的F12K培養液重懸后，按上述方法接種到細胞培養板中，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.5.2 多糖處理

待巨噬細胞貼壁后，吸棄上層液體，添加無血清的F12K 培養液，并將細胞分為多糖處理組和空白對照組。多糖處理組分別添加終質量濃度為10、20 和30 mg/L的無菌阿魏側耳胞外多糖水提組分，空白對照組添加等體積的F12K培養液，每組設3個重復。繼續培養24 h后，分別收集細胞和上層培養液，熒光探針法測定細胞中NO 和活性氧含量；酶聯免疫吸附實驗測定細胞培養上清液中的IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ的濃度。

將體外培養的小鼠脾淋巴細胞分為多糖處理組和空白對照組，多糖處理組分別添加終質量濃度為10、20和30 mg/L的無菌阿魏側耳胞外多糖多糖水提組分，空白對照組添加等體積的F12K培養液，每組設3個重復，37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養24 h。收集細胞培養液，酶聯免疫吸附實驗測定培養上清液中的IL-2和IFN-γ的濃度。

1.2.5.3 NO含量的測定

熒光探針法。按照DAF-FM DA 使用說明，將NO探針稀釋400倍，添加到不同處理組巨噬細胞的表面， 37 ℃避光孵育30 min，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡觀察和拍照，軟件IPP分析和測定平均光密度值(相對值)[19]。

1.2.5.4 細胞中活性氧測定

按照上述方法收集和接種巨噬細胞，多糖處理24 h。按照活性氧檢測試劑盒說明，用無血清F12K培養液稀釋DCFH-DA探針至終濃度為10 μmol/L，去除細胞培養液，PBS漂洗后，加入終濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA探針，37 ℃恒溫孵育20 min，無血清的F12K培養液洗滌3次，熒光顯微鏡觀察和拍照，軟件IPP分析和測定平均光密度值(相對值)。

1.2.5.5 IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的測定

酶聯免疫吸附試驗采用雙抗體一步夾心法[10]。取1.2.5.2細胞培養液，12 000 r/min離心10 min后收集上清液，按照試劑盒的說明操作，酶標儀檢測A450 nm，根據各標準品的標準曲線計算各組培養上清中IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ濃度。

1.2.6 統計分析

2 結果與分析

2.1 阿魏側耳胞外多糖的分離純化

使用優化后的培養基對阿魏側耳進行液體發酵，將發酵液過濾、離心、濃縮、醇沉干燥、除蛋白、透析(去除分子質量小于8 kDa組分)、濃縮和冷凍干燥后得到阿魏側耳胞外粗多糖。阿魏側耳胞外粗多糖經DEAE-52 纖維素柱分離，以超純水洗脫后，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，得到1個明顯主峰，洗脫曲線見圖1-A，命名為PFEPw(water extract component of exopolysaccharides fromP.ferulaeLanzi)。將PFEPw收集和冷凍干燥后經SephadexG-100葡聚糖凝膠柱進一步純化，洗脫曲線見圖1-B，可以看出，PFEPw的洗脫曲線出現4個獨立峰，分別命名為PFEPw-1、PFEPw-2、PFEPw-3和PFEPw-4，由于PFEPw-2、PFEPw-3和PFEPw-4組分多糖含量較低，較難收集足夠量進行后續研究，故僅對PFEPw-1組分進行收集、濃縮和冷凍干燥，作為下一步實驗的樣品。

A-DEAE-52 纖維素柱洗脫曲線;B-Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱洗脫曲線圖1 阿魏側耳胞外多糖經DEAE-52 纖維素和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱洗脫曲線Fig.1 Elution curve of crude exopolysaccharides from P.ferulae Lanzi by DEAE-52 cellulose column chromatography and Sephadex G-100 column chromatography

2.2 阿魏側耳胞外多糖水提組分分子質量和單糖組成

2.2.1 分子質量測定

采用HPGPC法測定葡聚糖標準品和阿魏側耳胞外多糖水提組分PFEPw-1的保留時間(圖2-A)，以葡聚糖標準品的lgMw為因變量，保留時間t為自變量進行相關回歸分析，得相關系數R=-0.953，P<0.05，表明，葡聚糖標準品平均分子質量對數lgMw與其保留時間t具有顯著的負相關關系，一元線性回歸方程為：lgMw=-0.926t+17.646。PFEPw-1的保留時間為13.842 min(圖2-B)，根據回歸方程計算其平均分子質量為67.3 kDa。

A-葡聚糖標準品;B-PFEPw-1圖2 葡聚糖標準品和PFEPw-1的HPGPC圖Fig.2 HPGPC of standard dextrans and PFEPw-1

2.2.2 單糖組成測定

將PFEPw-1水解后，采用高效液相色譜法進行單糖組成分析。由高效液相色譜結果(圖3)可知，PFEPw-1由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖組成，各單糖含量比為2.42∶3.90∶2.27∶1.41，其中D-葡萄糖含量最高，L-阿拉伯糖含量最低。

2.3 體外培養的巨噬細胞和脾淋巴細胞

參照王晶等[19]方法和小鼠脾淋巴細胞分離液使用說明，分別收集小鼠巨噬細胞和脾淋巴細胞，建立體外培養體系。結果顯示，培養24 h后，巨噬細胞貼壁或半貼壁生長，形狀不規則(圖4-A)，脾淋巴細胞懸浮生長，圓形(圖4-B)，2種細胞透光性較好，說明實驗建立的培養體系適合小鼠巨噬細胞和脾淋巴細胞的體外生長。

A-小鼠腹腔巨噬細胞;B-小鼠脾淋巴細胞圖4 體外培養的小鼠巨噬細胞和脾淋巴細胞(標尺= 100 μm)Fig.4 Murine peritoneal macrophages and spleen lymphocytes cultured in vitro (scale=100 μm)

2.4 阿魏側耳胞外多糖水提組分對巨噬細胞NO和活性氧產生的影響

DAF-FM DA探針和DCFH-DA探針可通過活細胞的質膜進入細胞質，分別被酯酶水解為DAF-FM和DCFH。DAF-FM和DCFH均無熒光或有微弱的熒光且不能透過質膜，DAF-FM可與細胞中的NO結合，產生綠色熒光，熒光強度或平均光密度顯示活細胞內NO的水平[19]，DCFH則被細胞內活性氧氧化為DCF，產生綠色熒光，熒光強度或平均光密度則可顯示活細胞內活性氧的水平。

為研究阿魏側耳胞外多糖水提組分PFEPw-1對巨噬細胞免疫能力的影響，分別用DAF-FM DA探針和DCFH-DA探針標記PFEPw-1處理后的巨噬細胞，IPP軟件測定相對平均光密度，結果顯示，與空白組相比，10～30 mg/L的PFEPw-1處理24 h后，NO熒光探針(圖5和圖6)和活性氧熒光探針(圖6和圖7)的平均光密度值均顯著增加(P<0.05)。說明，PFEPw-1處理24 h可促進巨噬細胞內NO和活性氧的產生。

A-空白對照組;B-10 mg/L PFEPw-1處理組C-20 mg/L PFEPw-1處理組;D-30 mg/L PFEPw-1處理組圖5 NO 熒光探針標記的小鼠巨噬細胞(標尺= 50 μm)Fig.5 Murine macrophage stained by NO fluorescence probe (scale=50 μm)

A-NO熒光的平均光密度值;B-活性氧熒光的平均光密度值圖6 小鼠巨噬細胞中NO熒光和活性氧熒光的平均光密度值Fig.6 The average optic density of NO fluorescence in murine macrophages in different groups注:*表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)

A-空白對照組;B-10 mg/L PFEPw-1處理組C-20 mg/L PFEPw-1處理組;D-30 mg/L PFEPw-1處理組圖7 DCFH-DA熒光探針標記的小鼠巨噬細胞(標尺= 100 μm)Fig.7 Murine macrophage stained by DCFH-DA fluorescence probe (scale=100 μm)

2.5 阿魏側耳胞外多糖水提組分對巨噬細胞IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ分泌量的影響

PFEPw-1處理小鼠巨噬細胞24 h后，離心收集細胞培養上清液，采用酶聯免疫吸附實驗測定其中的多種免疫相關細胞因子濃度。結果顯示，巨噬細胞培養上清液中可檢測到IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ，其中，TNF-α和IFN-γ的濃度較高，分別為(619.62±10.65) ng/L和(688.62±11.97) ng/L(表1)。與空白對照組相比，10、20和30 mg/L PFEPw-1處理組巨噬細胞培養上清液中TNF-α和IFN-γ的濃度顯著增加(P<0.05)(表1)；20和30 mg/L PFEPw-1處理組巨噬細胞培養上清液中IL-1和IL-6的濃度顯著增加(P<0.05)(表1)。說明，一定添加濃度的PFEPw-1可促進小鼠巨噬細胞對IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌。

表1 阿魏側耳胞外多糖水提組分對巨噬細胞IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ分泌量的影響Table 1 Effects of PFEPw-1 on the secretion of IL-1, IL-6, TNF-α and IFN-γ from murine macrophages

相關研究顯示，TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γ和NO是成熟單核細胞極化為M1型巨噬細胞后分泌的主要細胞因子或信號分子，M1型巨噬細胞可產生活性氮或活性氧，發揮機體免疫調節和抑制腫瘤細胞以及病原體增殖功能[20-21]。由此可見，阿魏側耳胞外多糖水提組分PFEPw-1可能通過提高巨噬細胞對NO和活性氧合成及TNF-α、IL-1、IL-6和IFN-γ的分泌，促進M1型巨噬細胞的成熟，調節巨噬細胞的免疫能力，這與CHEN等[22]研究結果一致。

2.6 阿魏側耳胞外多糖水提組分對體外培養的脾淋巴細胞IL-2和IFN-γ分泌量的影響

為研究PFEPw-1對淋巴細胞免疫功能的影響，使用小鼠脾臟淋巴細胞分離液無菌分離脾淋巴細胞，建立體外培養體系；收集PFEPw-1處理后的脾淋巴細胞培養上清，采用酶聯免疫吸附實驗測定其中的IL-2和IFN-γ濃度。結果顯示，體外培養的脾淋巴細胞可分泌IL-2和IFN-γ，2種細胞因子濃度分別為(365.40±16.85) ng/L和(258.67±5.83) ng/L(表2)。與空白對照組相比，20和30 mg/L PFEPw-1處理組脾淋巴細胞的培養上清中IL-2和IFN-γ濃度顯著增加(P<0.05)，具有濃度依賴性(表2)。說明一定添加濃度的PFEPw-1可促進小鼠脾淋巴細胞對IL-2和IFN-γ的分泌。

表2 阿魏側耳胞外多糖水提組分對脾淋巴細胞IL-2和IFN-γ分泌量的影響Table 2 Effects of PFEPw-1 on the secretion of IL-2 and IFN-γ from spleen lymphocytes

IL-2是免疫系統中重要的細胞因子之一，可促進抗體形成、干擾素和腫瘤壞死因子的形成和釋放，具有顯著的免疫增強作用[23]。IFN-γ是由巨噬細胞和T淋巴細胞分泌的細胞因子，可激活巨噬細胞和淋巴細胞，促進細胞產生活性氧和氮的中間體或多種炎癥因子，增強巨噬細胞的吞噬能力和淋巴細胞的免疫能力，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調節功能[24]。因此，阿魏側耳胞外多糖水提組分PFEPw-1可能通過促進脾淋巴細胞對IL-2和IFN-γ的分泌，調節脾淋巴細胞的免疫能力。

相關研究顯示，多糖的單糖組成和分子質量與其免疫調節活性有關，半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖等單糖與多糖的免疫調節活性呈正相關[25]，分子質量較大的多糖可能含有較多的高度重復結構，可以多向性交叉連接質膜表面受體，特異性增強免疫調節效果[26]。因此，阿魏側耳胞外多糖水提組分PFEPw-1 可激活體外培養的巨噬細胞和脾淋巴細胞，具備較強的免疫調節活性，可能與其含有較高濃度的半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖以及分子質量較大有關。

3 結論

本研究將培養阿魏側耳菌絲體的發酵液進行離心、濃縮、醇沉、除蛋白、透析、濃縮和冷凍干燥后得到阿魏側耳胞外粗多糖，再用DEAE-52 纖維素柱層析和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析得到阿魏側耳胞外多糖水提組分PFEPw-1，平均分子質量為64.2 kDa，單糖組成為D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖等，各單糖含量比依次為2.42∶3.90∶2.27∶1.41。體外細胞實驗結果表明，在一定實驗濃度范圍內，PFEPw-1可激活巨噬細胞，促進巨噬細胞中NO和活性氧合成(P<0.05)以及TNF-α、IL-1、IL-6和IFN-γ的分泌(P<0.05)，促進脾淋巴細胞對IL-2和IFN-γ的分泌(P<0.05)。本研究初步探究了阿魏側耳胞外多糖水提組分PFEPw-1性質及其對體外培養的巨噬細胞和脾淋巴細胞的免疫調節作用，為阿魏側耳胞外多糖的生產和應用提供理論基礎。