乳酸菌B2-1發(fā)酵產(chǎn)物中雙功能活性肽組分研究

郭皓，丁琳，樊磊，楊文欽，靳瑾健，藏傳剛，劉宇超，關(guān)宏*

1(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院科研處，黑龍江 齊齊哈爾，161006)2(黑龍江省農(nóng)墾齊齊哈爾管理局中心醫(yī)院藥劑科，黑龍江 齊齊哈爾，161000)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的日益提高，心血管疾病、癌癥等與機(jī)體氧化傷害有關(guān)的疾病發(fā)病率不斷提高[1-2]，如何有效維護(hù)人體健康，防止心血管疾病、腫瘤已成為人們普遍關(guān)注的社會(huì)問(wèn)題。許多疾病可稱為“自由基”疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，心臟病、腫瘤、衰老、糖尿病等數(shù)百種疾病都與自由基有關(guān)，能否有效地清除自由基成為解決各類疾病的關(guān)鍵問(wèn)題[3-5]。近年來(lái)生物活性肽受到廣泛的重視，開(kāi)發(fā)既具有抗氧化又具有抗腫瘤活性的雙功能活性肽用以預(yù)防和治療自由基引發(fā)的疾病[6]，減少心腦血管疾病以及腫瘤、機(jī)體老化引發(fā)的各類疾病的發(fā)病率具有重要的意義。

乳清蛋白是一類利用現(xiàn)代生產(chǎn)工藝技術(shù)從牛奶中提取出來(lái)的蛋白質(zhì)，乳清蛋白具有高蛋白、低脂肪、易于消化吸收、含有豐富必需氨基酸、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn), 被稱為“蛋白之王”[7]。乳清蛋白生物活性成分中含有豐富的半胱氨酸，使其可以影響機(jī)體的抗氧化能力。本研究前期已證實(shí)乳酸菌發(fā)酵乳清蛋白產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性和抗腫瘤活性[8-9]。而在活性肽的制備過(guò)程中，其分離純化技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)。由于發(fā)酵液具有成分復(fù)雜、分子質(zhì)量小等特點(diǎn)，其分離純化過(guò)程變得相對(duì)較難，想要分離純化出單一肽段難度大，而且目前對(duì)多肽的研究大多僅集中于單一活性的評(píng)價(jià)[10]，而雙功能或多功能的多肽研究較少，可參考性較低，缺乏試驗(yàn)數(shù)據(jù)，但是因其安全性高、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)[11-12]，以抗氧化、抗腫瘤為主的雙功能活性肽具有很好的開(kāi)發(fā)前景[13-14]。

因此，本課題的研究目的是通過(guò)對(duì)乳酸菌的乳清蛋白代謝發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)大孔吸附樹脂及凝膠過(guò)濾層析方法進(jìn)行分離純化，以獲得雙功能活性肽組分，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)抗氧化、抗腫瘤活性，從而為開(kāi)發(fā)抗氧化、抗腫瘤的雙功能活性肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，生工生物工程股份有限公司；ABTS、水溶性維生素E(Trolox)，Sigma-Aldric公司；噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)，Amersco公司；鄰苯二甲醛(O-phthaldialdehyde，OPA)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。色譜柱填料：大孔吸附樹脂D101，艾美科健中國(guó)生物醫(yī)藥有限公司；葡聚糖凝膠G15，美國(guó)GE公司。

1.2 培養(yǎng)基

乳清蛋白-MRS培養(yǎng)基：根據(jù)改良MRS培養(yǎng)基作出調(diào)整，具體組成成分如下，脫鹽乳清粉10 g、牛肉提取物10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、醋酸鈉5 g、檸檬酸鈉2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g，加水至1 L，121 ℃，滅菌15 min。

1.3 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)(6 L)，美國(guó)Labconco公司；UV-2550紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Safire2酶標(biāo)儀，奧地利Tecan公司；IS09001恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；Z36HK大容量高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hermle公司；Sepacore中壓制備色譜(中壓色譜柱 25 mm×460 mm)，瑞士BUCHI公司；AKTA Explorer100全自動(dòng)蛋白層析系統(tǒng)(蛋白層析柱16 mm×100 mm)，美國(guó)GE公司。

1.4 乳酸菌B2-1發(fā)酵液的制備

乳酸菌B2-1是由玉米浸泡液中分離純化獲得的，現(xiàn)保存在齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院微生態(tài)工程技術(shù)研究中心。挑取B2-1菌種接種于1 mL滅菌的乳清蛋白-MRS培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)48 h，連續(xù)擴(kuò)培2次后，取培養(yǎng)物按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種于乳清蛋白-MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5周后，6 000 r/min離心10 min，取上清液凍干，此為乳酸菌B2-1的乳清蛋白代謝產(chǎn)物發(fā)酵液凍干粉，存放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 乳酸菌B2-1發(fā)酵乳清蛋白代謝產(chǎn)物的分離純化

1.5.1 大孔吸附樹脂D101柱層析分離

對(duì)乳酸菌B2-1的乳清蛋白代謝產(chǎn)物發(fā)酵液凍干粉采用大孔吸附樹脂D101層析柱分離純化，取凍干粉3 g溶解于20 mL純凈水離心后上樣，先用2～3個(gè)柱體積純凈水洗脫，再采用梯度乙醇溶液和無(wú)水乙醇洗脫，流速為2.5 mL/min，采用自動(dòng)收集器收集分離組分，每管收集時(shí)間為2 min，每隔3管測(cè)定餾分的214、254、280 nm處的吸光度值、多肽含量及ABTS陽(yáng)離子自由基清除率，以體積為橫坐標(biāo)，以吸光度、多肽含量及ABTS陽(yáng)離子自由基清除率為縱坐標(biāo)，分別繪制曲線，綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果收集3個(gè)組分，分別命名為F1、F2及F3，備用待測(cè)。

1.5.2 葡聚糖凝膠G15柱層析分離

將大孔吸附樹脂D101分離出的組分中具有較高抗氧化活性和抗腫瘤活性的F3組分采用葡聚糖凝膠G15柱進(jìn)行分離純化，采用超純水洗脫，F(xiàn)3組分上樣量為5 mL(0.07 g/mL)，流速為0.7 mL/min，每管收集體積為8 mL，采用自動(dòng)收集器收集分離組分，根據(jù)出峰位置收集2個(gè)組分，命名為F3-1及F3-2，備用待測(cè)。

1.5.3 多肽含量的測(cè)定

采用OPA法進(jìn)行測(cè)定[15]。取20 μL樣品加入到150 μL的OPA試劑中，混勻后于室溫下反應(yīng)2 min，在340 nm下測(cè)定吸光度值，以水為空白對(duì)照，絲氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，計(jì)算樣品多肽含量。

1.5.4 SDS-PAGE

取各樣品10 μL，加入10 μL上樣緩沖液后，煮沸3 min，待其冷卻后備用。配制分離膠，待聚合完成后，配制濃縮膠，按順序加樣后，預(yù)電泳電壓75 V電泳至分離膠處，改用120 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移到距前沿1～2 cm處停止電泳。將電泳結(jié)束后的凝膠取出，適當(dāng)剪切，在考馬斯亮藍(lán)R250染色液中置于搖床上室溫緩慢振蕩，染色2 h，脫色液脫色后拍照[16]。

1.6 抗氧化活性的測(cè)定

抗氧化活性測(cè)定采用ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定[17]。利用50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液配制待測(cè)樣品溶液，經(jīng)稀釋后制備不同濃度的工作液。ABTS陽(yáng)離子自由基工作液，使用前以0.01 mol/L Tris-HCl(pH 7.4)適當(dāng)稀釋，使OD值在0.8左右。將40 μL質(zhì)量濃度為1 g/L的樣品與160 μL ABTS 試劑混勻，室溫條件下避光反應(yīng)6 min。利用酶標(biāo)儀在734 nm處測(cè)定吸光度值。將50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液作為空白對(duì)照，Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.7 抗腫瘤活性檢測(cè)

抗腫瘤活性測(cè)定采用MTT法[16]。將消化好的人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞、人口腔癌細(xì)胞系Cal-27細(xì)胞和KB細(xì)胞分別接種于96孔板，接種細(xì)胞的起始濃度為1×104個(gè)/孔，樣品作用細(xì)胞的時(shí)間為48 h，每個(gè)處理組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。48 h后每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后終止培養(yǎng)，2 000 r/min離心10 min后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm，細(xì)胞的抑制率計(jì)算公式如(2)所示：

(2)

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌B2-1的形態(tài)

將26種菌株接種到乳清蛋白-MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用ABTS陽(yáng)離子自由基清除實(shí)驗(yàn)及MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)篩選，最終得到菌株B2-1，其菌體形態(tài)如圖1所示，菌株B2-1菌體呈雙桿狀，短小的桿菌，兩端圓形。菌體成單、成對(duì)或成鏈，不形成芽孢。

圖1 乳酸菌B2-1的形態(tài)示意圖Fig.1 Morphological diagram of Lactobacillus B2-1

2.2 乳酸菌B2-1發(fā)酵乳清蛋白代謝產(chǎn)物的分離純化

2.2.1 大孔吸附樹脂D101層析柱分離純化

對(duì)乳酸菌B2-1的乳清蛋白代謝產(chǎn)物發(fā)酵液的凍干粉經(jīng)大孔吸附樹脂D101層析柱分離，通過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)其洗脫情況，結(jié)果如圖2所示。大孔吸附樹脂D101層析柱依次分離出來(lái)3個(gè)峰，分別為F1、F2和F3。對(duì)分離物進(jìn)行多肽含量及ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的跟蹤檢測(cè)，結(jié)果顯示多肽含量及ABTS陽(yáng)離子自由基清除率較高的部分主要分布在峰F1、F2和F3上，因此綜合上述實(shí)驗(yàn)，收集了3個(gè)大孔吸附樹脂D101層析柱分離組分，經(jīng)冷凍干燥分別命名為F1、F2和F3，每個(gè)組分的得率分別為25.72%、11.75%和3.29%。

a-大孔吸附樹脂柱D101層析圖譜示意圖;b-大孔吸附樹脂柱D101層析餾分多肽含量和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率曲線圖2 大孔吸附樹脂D101層析圖譜及餾分多肽含量和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率曲線Fig.2 Chromatogram of macroporous adsorption resin D101, polypeptide content and ABTS cationic free radical scavenging curve

對(duì)收集的3個(gè)組分F1、F2和F3進(jìn)行多肽含量、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和圖3所示。多肽含量和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的均最高的組分是F3，相比于乳酸菌B2-1 乳清蛋白代謝產(chǎn)物發(fā)酵液的凍干粉，經(jīng)過(guò)大孔吸附樹脂D101分離后組分的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率提高近2倍，因此認(rèn)為F3組分是具有抗氧化活性的組分?？鼓[瘤活性的初步篩選實(shí)驗(yàn)選擇了3種細(xì)胞，分別為人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，人口腔癌KB細(xì)胞和Cal-27細(xì)胞，每個(gè)組分作用時(shí)間為48 h。由圖3可知，F(xiàn)1組分對(duì)3種細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯；F2組分對(duì)3種細(xì)胞增殖的抑制作用的順序是LoVo細(xì)胞>KB細(xì)胞>Cal-27細(xì)胞，其中質(zhì)量濃度8 g/L的F2組分對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的抑制率已達(dá)到50%；F3組分對(duì)3種細(xì)胞增殖的抑制作用的順序是LoVo細(xì)胞>KB細(xì)胞>Cal-27細(xì)胞，是3種組分中抗腫瘤效果最好的，質(zhì)量濃度8 g/L的F3組分對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的抑制率接近70%。

圖3 大孔吸附樹脂D101柱層析各組分對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of each component of macroporous adsorption resin D101 column chromatography on tumor cell proliferation注：與空白組相比，a表示P<0.01，b表示P<0.05(下同)

表1 大孔吸附樹脂D101柱層析各組分收率、多肽含量及ABTS陽(yáng)離子自由基清除率Table 1 The yield, polypeptide content, and ABTS cationic free radical scavenging rate of each component of macroporous adsorption resin D101 column chromatography

對(duì)各組分的樣品進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示F1組分在10、20 kD左右有微弱條帶，在F2組分的蛋白電泳未顯示出條帶，而F3組分在70 kDa及10～20 kDa附近均呈現(xiàn)較明顯的條帶，而各個(gè)組分在凝膠底部均出現(xiàn)條帶，說(shuō)明F1、F2和F3組分均有較小分子質(zhì)量的多肽，因此，綜合各組分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從抗腫瘤實(shí)驗(yàn)和抗氧化實(shí)驗(yàn)初步篩選得到的結(jié)論是F3組分最優(yōu)，是同時(shí)具有抗氧化和抗腫瘤雙功能的組分，因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選擇F3進(jìn)行繼續(xù)分離。

M-Marker圖4 大孔吸附樹脂D101分離組分SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis results of components separated by macroporous adsorption resin D101 column chromatography

2.2.2 葡聚糖凝膠G15層析柱分離純化

經(jīng)大孔吸附樹脂D101柱層析分離后，洗脫組分F3經(jīng)葡聚糖凝膠G15層析柱進(jìn)行分離純化，洗脫曲線如圖5所示，洗脫后得到2個(gè)組分，分別命名為F3-1和F3-2。

圖5 F3的葡聚糖凝膠G15柱層析圖譜Fig.5 Sephadex G15 gel column chromatography of F3 component

對(duì)收集的2個(gè)組分進(jìn)行多肽含量、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率及MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和圖6所示。相比于F3-2組分，F(xiàn)3-1的多肽含量為0.353 g/L，ABTS陽(yáng)離子自由基清除率為69.29%。在MTT試驗(yàn)中，F(xiàn)3-1對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制率更顯著，其中，對(duì)LoVo細(xì)胞的增殖的抑制率最高，當(dāng)F3-1的質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí)，抑制率達(dá)到75.36%，因此，可以認(rèn)為F3-1組分是具備雙功能活性肽組分。

表2 F3的葡聚糖凝膠G15柱層析組分的多肽含量及ABTS陽(yáng)離子自由基清除率Table 2 The polypeptide content and ABTS free radical scavenging rate of Sephadex G15 gel column chromatography of F3 component

圖6 G15層析柱分離后組分各組分對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of each component of Sephadex G15 gel column chromatography of F3 component on tumor cell proliferation

3 結(jié)論

生物活性肽是指對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生物活性的肽類化合物，它屬于蛋白質(zhì)片段，起著調(diào)節(jié)機(jī)體功能平衡的作用[18]。隨著乳源生物活性肽研究的興起與產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，開(kāi)發(fā)既具有抗氧化又具有抗腫瘤活性的雙功能活性肽用以預(yù)防和治療氧化及自由基引發(fā)的疾病，減少心腦血管疾病、腫瘤及機(jī)體老化引發(fā)的各類疾病的發(fā)病率具有重要的意義[19]。但由于目前中國(guó)整體乳清蛋白處理技術(shù)不發(fā)達(dá)，造成了大量產(chǎn)生的乳清蛋白無(wú)可用之地，其傾瀉也對(duì)自然環(huán)境造成了一定的壓力[20]。因此，開(kāi)發(fā)以抗氧化、抗腫瘤為主的乳源雙功能活性肽有很好的發(fā)展前景。

本研究通過(guò)大孔吸附樹脂和凝膠過(guò)濾層析對(duì)乳酸菌B2-1的乳清蛋白代謝發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，提供一種抗氧化、抗腫瘤的雙功能活性肽組分的制備方法。此種方法既有效的利用了乳清蛋白，又可以得到具有生物功能的活性肽成分，同時(shí)項(xiàng)目中的原料價(jià)格低廉，因此具有巨大的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益。