核桃青皮提取物對非酒精性脂肪肝的作用

方瓊蓮，王蒙蒙，喬雪，李欣坪，黃豐，林玉萍，趙聲蘭

(云南中醫藥大學 中藥學院,云南省南藥可持續利用重點實驗室,云南 昆明，650500)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種慢性進行性肝臟疾病，病理過程始于肝脂肪沉積，可進展為非酒精性脂肪肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌等，已成為全球終末期肝病的主要病因，影響全球約25%的人群[1-2]。NAFLD常伴有高血脂、高血壓、冠心病等，增加心血管疾病發生率和死亡風險，已成為威脅人群健康和生命的重要疾病[3]。研究顯示，脂質過氧化及炎癥因子失衡是NAFLD病情發展過程中致肝細胞損傷的重要原因[4]。

核桃青皮是胡桃科植物胡桃楸未成熟果實的青果皮，又名青龍衣，主要分布在河北、山東、云南等省[5-6]。核桃青皮味苦、澀，性平，微寒，有小毒，具有清熱解毒、祛風療癬、止痛止痢等功效[7-8]。現代藥理研究表明，核桃青皮提取物具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、治療皮膚病、殺蟲等藥理活性[9-11]。云南是我國著名的核桃主產區之一，核桃年產量居全國之首，但核桃青皮的利用價值低，大多丟棄在農間地頭，不僅資源浪費還會污染環境[12]。為促進資源的綜合利用，本文研究核桃青皮不同溶劑提取物對NAFLD大鼠的體重變化、肝臟病理學改變及血清中甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷氨酸氨基轉移酶(glutamate aminotransferase，ALT)水平、肝臟丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性的影響，以期能揭示其對NAFLD損傷大鼠的作用活性部位，為資源開發與利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃青皮(walnut green husk)為核桃未成熟的外果皮，采自云南省麗江市華坪縣；SPF級雄性SD大鼠36只，6～8周齡，體重180～200 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SCXK(湘)2016-0002]),動物倫理學審查編號R-0620170043。

膽酸鈉，深圳百晟精細化有限公司；膽固醇，廣州億寶萊生物科技有限公司；豬油，四川瑞洋油脂有限公司；蛋黃粉，實驗室購買雞蛋后自制；0.9%氯化鈉注射液，廣西裕源有限公司；75%乙醇消毒液，昆明利健消毒制品有限公司；水飛薊賓膠囊，天津天力士圣特制藥有限公司(國藥準字：H20040299)；TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST試劑盒，南京建成生物工程研究所；MDA(批號：120718190301)、GSH-Px(批號：112618190311)、SOD(批號：032219190408)，上海碧云天生物技術有限公司；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純，中國天津市化學試劑一廠。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋，上海醫療器械五廠；INFINITE M200 PRO酶標儀，瑞士TECAN公司；湘儀H1850R臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；先行者TM(OHAUS)分析天平，上海奧豪斯有限公司；DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 核桃青皮提取物的制備

核桃青皮干燥后粉碎成粗粉，取500 g用2 000 mL 95%(體積分數)乙醇加熱回流提取3次，每次3 h；合并3次提取液，減壓蒸餾濃縮得乙醇浸膏(浸膏得率20.40%)，冷凍干燥，即得乙醇提取物(102 g)。取部分乙醇提取物，加適量水溶解，形成混懸溶液，再依次用乙酸乙酯、正丁醇各200 mL進行萃取，分別萃取4次；合并相同萃取部分，回收溶劑濃縮成浸膏(浸膏得率分別為18.55%、21.89%)，冷凍干燥，得到乙酸乙酯萃取物(18.92 g)和正丁醇萃取物(22.33 g)。

1.3.2 大鼠肝損傷模型的建立與試驗設計

36只SPF級SD雄性大鼠飼養于云南中醫藥大學動物房，實驗室條件為室溫18～25 ℃、濕度(55±5)%，隨機選取6只為正常組，給予正常飼料；其余30只大鼠給予高脂飼料[13](82.5%普通飼料、2%膽固醇、10%豬油、5%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉)，連續喂養12周，建造NAFLD大鼠肝損傷模型。造模成功的30只大鼠隨機分為5組，即模型組(生理鹽水)、陽性對照組(水飛薊賓12.6 mg/kg)、核桃青皮乙醇提取物組(300 mg/kg)、核桃青皮乙酸乙酯萃取物組(300 mg/kg)、核桃青皮正丁醇萃取物組(300 mg/kg)，每組6只。各組大鼠自由飲水和進食，晝夜交替周期12 h，每天灌胃給藥1次，連續給藥6周，給藥期間每周監測大鼠體重、飲水量和進食量。末次給藥后禁食12 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，4 ℃靜止30 min后，低溫離心(3 000 r/min)15 min，分離得到血清[14]；迅速取出肝臟，用0.9%(質量分數)的生理鹽水漂洗，部分按肝組織與生理鹽水1∶9(g∶mL)制備勻漿，于-4 ℃、3 500 r/min離心15 min，吸取上層勻漿清液[15]；部分用4%多聚甲醛固定，脫水制成石蠟切片，用蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)進行組織病理學觀察[16]。

1.3.3 病理切片觀察

HE染色后的各組大鼠肝組織切片，置于顯微鏡下觀察病理切片并采集圖像。

1.3.4 肝比重的測定

肝比重的測定如公式(1)所示：

(1)

1.3.5 生化指標的檢測

血清中的TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT和AST含量的測定:取上述制備各組大鼠的血清，按照試劑盒說明書，檢測各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST含量。

肝組織中的TG、TC、ALT、AST、MDA含量和SOD、GSH-Px活性的測定:取上述各組大鼠的肝組織勻漿上清液，按照試劑盒說明書，檢測各組大鼠肝臟中TG、TC、ALT、AST、MDA的含量和SOD、GSH-Px的活性。

1.4 統計學處理

2 結果與分析

2.1 核桃青皮提取物對NAFLD大鼠體重的影響

核桃青皮不同提取部位對大鼠體重的影響結果如表1所示。給藥前到實驗結束，正常組、模型組、水飛薊賓組、核桃青皮乙醇提取物組、乙酸乙酯萃取物組、正丁醇萃取物組大鼠的體重均逐日增加。其中模型組體重上升趨勢較為明顯，而水飛薊賓組、核桃青皮乙醇提取物組、乙酸乙酯萃取物組、正丁醇萃取物組大鼠的體重隨給藥周數的增加上升緩慢，特別是核桃青皮乙酸乙酯萃取物組和正丁醇萃取物組大鼠體重在實驗結束時與正常組較為接近，說明核桃青皮提取物具有降低NAFLD大鼠體重的作用。

表1 各實驗組大鼠的體重變化Table 1 Body weight changes of rats in each experimental group after administration

2.2 肝損傷病理切片分析

各組大鼠肝損傷病理切片結果如圖1所示。正常組(圖1-a)中大鼠肝細胞以中央靜脈叢呈放射狀分布、排列整齊、結構清晰，肝小葉結構完整，形態正常；模型組(圖1-b)大鼠肝小葉結構破壞，肝索和肝竇結構不清晰，部分肝細胞壞死，有炎性細胞浸潤，表明肝損傷模型復制成功。水飛薊賓組(圖1-c)和核桃青皮不同極性部位(圖1-d～圖1-f)可改善肝細胞的損傷程度，肝小葉結構完整，細胞排列整齊，大小均勻，分界清楚，病變情況有較大改善，其中核桃青皮正丁醇萃取物改善肝損傷病理組織的作用最為明顯。

a-正常組；b-模型組；c-水飛薊賓組；d-核桃青皮乙醇提取物組；e-核桃青皮乙酸乙酯萃取物組；f-核桃青皮正丁醇萃取物組圖1 各實驗組大鼠肝組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of rat liver tissues in each experimentalgroup(×200)

2.3 肝損傷病理切片分析

核桃青皮不同提取物對大鼠肝比重的影響結果如圖2所示。與正常組比較，模型組肝比重急劇升高(P<0.001)。與模型組比較，水飛薊賓組和核桃青皮不同提取物顯著降低(P<0.001)，說明核桃青皮不同提取物皆有較好降低肝比重的作用。

圖2 核桃青皮提取物對大鼠肝比重的影響Fig.2 Effects of the extract of walnut green husk on liver specific gravity of rats注：與正常組相比，###P<0.001；與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001(下同)

2.4 核桃青皮提取物對肝損傷大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST含量的影響

核桃青皮不同提取物對肝損傷大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST含量的影響結果如圖3所示。與正常組比較，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C、ALT、AST含量顯著升高(P<0.001)，HDL-C顯著降低(P<0.001)，表明肝損傷模型復制成功。與模型組比較，核桃青皮不同提取物組TG、TC含量顯著降低(P<0.001)，說明核桃青皮具有較好的降脂作用。由于脂肪的過度沉積會引起細胞質中自由基增加和氧化應激反應，引起線粒體和細胞膜損傷，增加通透性，從而使血清中AST和ALT的含量升高。

2.5 核桃青皮對肝損傷大鼠肝組織中MDA、GSH-Px、SOD活性的影響

核桃青皮提取物不同部位對大鼠肝組織中MDA、GSH-Px、SOD活性的影響結果如圖4所示。與正常組比較，模型組大鼠肝組織MDA的含量明顯升高(P<0.001)，GPS-Px、SOD活性顯著降低(P<0.001)，表明肝損傷模型復制成功。與模型組比較，水飛薊賓和核桃青皮不同提取物均可顯著降低肝勻漿中MDA含量(P<0.001，P<0.05)，顯著增強GPS-Px和SOD的活性(P<0.001)，其中核桃青皮正丁醇萃取物的效果更明顯。

a-TC；b-HDL-C；c-TG；d-LDL-C；e-AST；f-ALT圖3 核桃青皮提取物對大鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST的影響Fig.3 Effects of the ethanol extract of walnut green husk on the level of TG, TC, HDL-C, LDL-C, ALT, AST in serum of rats

a-MDA含量；b-SOD活性；c-GSH-Px活性圖4 核桃青皮提取物對大鼠肝組織中MDA含量和SOD、GSH-Px活性的影響Fig.4 Effects of the extract of walnut green husk on the level of MDA and SOD, GSH-Px activity in liver of rats

3 結論

核桃(JuglansregiaL.)屬于胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(JuglansL.)，目前中國是最大的核桃生產國(約170萬t)[17-18]。研究報道，胡桃屬植物具有強勁的抗氧化、抗腫瘤、殺菌和止痛等功能[19]，核桃青皮乙醇提取物具有較強的抗氧化能力[20]，能有效減輕高果糖(high-fructose，HF)飲食引起的肝損傷[21]。而植物來源的抗氧化劑在預防代謝綜合征和由長期高脂肪、高糖飲食引起的代謝疾病方面顯示出潛在的生物學效應[22]。為明確核桃青皮對高脂飼料誘導的NAFLD具有改善作用和抗氧化活性部位。本實驗研究核桃青皮95%乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物對高脂飼料誘導的NAFLD的作用。

水飛薊賓有抗脂質過氧化、消除自由基、維持細胞膜穩定性和促進肝細胞再生的作用，對于各種原因引起的急慢性肝炎、脂肪肝的肝功能異常等均具有治療作用，是天然的保肝藥，所以選擇其為陽性藥[23]。大鼠的體重、肝比重、TG、TC、HDL-C、LDL-C是反應大鼠肥胖程度的重要指標；ALT和AST是診斷肝功能障礙的重要指標[24]，當肝臟損傷時，ALT和AST從肝細胞進入血液，導致血液中ALT和AST含量明顯升高[25]。MDA是機體內脂質過氧化的產物之一，可間接反映細胞膜脂損傷程度；當肝細胞氧化損傷時，SOD、GSH-Px不斷消耗清除超氧化物、自由基及有害物質等，其含量可反映肝組織過氧化損傷的程度[26-27]。

本研究結果顯示，核桃青皮乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物可減輕成年大鼠肝臟質量，減少肝臟脂肪堆積，降低肝比重，降低大鼠血清中TG、TC、LDL-C、ALT、AST含量，升高HDL-C含量，且具有顯著性差異；能改善肝組織病理損傷；顯著性降低肝勻漿中MDA含量并升高GSH-Px、SOD含量；其中，正丁醇萃取物表現出更好的效果。因此，核桃青皮能調節高脂飼料誘導NAFLD模型大鼠的肝脂水平，改善肝損傷，其正丁醇部位有效活性成分需進一步研究闡明。