通過發酵優化提高大腸桿菌生產L-半胱氨酸產量

張博，史永吉，楊輝，吳梓丹，陳開，蔡雪，柳志強，鄭裕國

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州，310023)

半胱氨酸(cysteine，Cys)是生物體內常見的硫源供體，其L型具有生物學活性。L-Cys是蛋氨酸、硫胺素以及谷胱甘肽等生物體內常見物質的重要組成成分[1]。L-Cys在細胞生長和代謝過程中起著重要作用，包括蛋白質的折疊、修飾、催化活性的調節等[2]。此外，L-Cys可以通過氧化應激反應對細胞起保護作用[3]。作為生物體中一種重要氨基酸，L-Cys在醫藥、食品、化妝品和飼料行業中有廣泛應用[4]。由于L-Cys活性巰基大量積累會對生物體產生毒性，因此制約了其作為發酵產物在微生物中進行大規模生產[5]。

L-Cys的生物合成途徑和調節機制已被廣泛研究。大腸桿菌(Escherichiacoli)[6]、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)[7]、菠蘿泛菌(Pantoeaanantics)[8]、卡式棘阿米巴氏菌(Acanthamoebacastellanii)[9]以及鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)[10]等均可以作為發酵菌株生產L-Cys。其中，以E.coli和C.glutamicum作為宿主菌最為常見。KAWANO等[11]研究發現E.coli中新的硫代硫酸鹽利用途徑，結合yciW基因的敲除，L-Cys 產量顯著提升[12-13]。NAKATANI等[6]通過過表達氧化還原蛋白NrdH、亞硫酸鹽還原酶CysI以及半胱氨酸合酶CysK提高L-Cys產量，降低了前體物質S-磺基半胱氨酸(S-sulfo-L-cysteine,SSC)積累。NONAKA等[14]通過敲除主要的半胱氨酸降解酶YhaM,顯著改善了L-Cys的合成。YAMAZAKI等[15]發現了L-Cys轉運蛋白YdjN在E.coli中參與SSC的轉運，YdjN的表達受L-CysB調控。LIU等[16-18]利用代謝工程手段嘗試不同的模塊優化組合，最終在1.5 L發酵罐中得到了8.34 g/L的L-Cys。

除代謝改造工程菌株以獲得高產菌株外，通過優化營養成分和培養條件來提高目標產物產量的方法也發揮著至關重要的作用。目前已有多種統計學方法應用于發酵過程的建模和優化[19]。其中，響應面分析方法較為成熟，其優勢在于在多變量系統中能快速篩選關鍵因素，通過爬坡實驗找到中心點附近位置以及整體連續考慮中心點附近的規律[20]。與傳統方法相比，即使對其中的作用過程知之甚少，通過響應面法建立模型，測試不同變量之間的整體關系，也可得到最優響應值。

本研究以E.coliMCYS-7菌株為生產菌，利用響應面分析方法對培養基組分和濃度進行優化。同時，在2 L 發酵罐中優化了發酵條件，結合外源添加甜菜堿、氨基酸等物質，開發出了一條有效的L-Cys發酵工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

生產菌株為E.coliMCYS-7(保藏號為CCTCC NO.M 2019108)。

1.1.2 試劑與儀器

L-Cys等各類氨基酸標準品、維生素B1、3，5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)、4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯(4-chloro-3,5-dinitrobenzotrifluoride，CNBF)、甜菜堿，中國百靈威；氨芐青霉素，中國生工；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，上海生工；乙酸鈉，溫州吉翔化工有限公司；乙腈，Tedia 公司。除另有說明外，所有其他化學品和試劑均為分析純，并購自商業渠道。

Eppendorf AG紫外分光光度計、Thermo Scientific U3000超高壓高效液相色譜系統，德國賽默飛；Waters高效液相色譜系統,美國沃特世；C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)，中國月旭；軌道培養箱搖床ZWYR-D2402，上海智域；2 L四聯微小型平行生物反應器，上海迪必爾。

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L)：蛋白胨 10，酵母提取物5,NaCl 10;基礎MS培養基：葡萄糖 20 g/L，硫酸銨 16 g/L，酵母粉 2 g/L，硫代硫酸鈉 2 g/L，蛋白胨 1 g/L，磷酸二氫鉀 1 g/L，鹽溶液 1 mL/L，維生素B15 mg/L，CaCO310 g/L；補料培養基：葡萄糖 300 g/L，硫酸銨10 g/L，硫代硫酸鈉12.5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，鹽溶液 1 mL/L，維生素B15 mg/L。鹽溶液配制(g/L)：MnSO4·8H2O 5，MgSO4·7H2O 500，ZnSO45，FeSO4·7H2O 10。所有培養基均要加入100 mg/L的氨芐青霉素。

1.2 培養條件

1.2.1 搖瓶發酵

種子液的制備：從活化平板中將MCYS-7單菌落接種于10 mL LB試管，并在37 ℃和180 r/min條件下于軌道培養箱中搖床培養12 h。

搖瓶發酵：接種量為5%，裝液量20 mL/500mL，30 ℃和180 r/min條件下培養，當培養進行至6 h后添加0.9 mmol/L的IPTG，培養48 h。

1.2.2 發酵罐發酵

一級種子液制備：見1.2.1。

二級種子液制備：取一級種子液1%(體積分數)，裝液量100 mL/500mL，30 ℃和180 r/min條件下于軌道箱中搖床培養12 h。

發酵罐發酵：使用2 L四聯發酵罐，接種量為10%，裝液量1 L/2L，用50%(體積分數)NH3·H2O和1 mol/L H3PO4溶液自動控制pH，培養溫度30 ℃，當生長至OD600=20左右時加入0.9 mmol/L的IPTG，通過控制攪拌槳轉速(0～800 r/min)以及通氣量[0～5 m3/(m3·min)]來維持溶解氧在30%以上，當培養基初始的葡萄糖耗盡時，補料流加以維持發酵過程中葡萄糖質量濃度在5 g/L以下。發酵過程中定期取樣檢測相關參數。

1.3 響應面模型

響應面分析是多因素建模分析的有效方法，可在多變量系統中快速篩選關鍵因素，通過爬坡實驗找到中心點附近位置以及整體連續考慮中心點附近的規律。與傳統方法相比，即使對其中的作用過程知之甚少，通過響應面法建立模型，測試不同變量之間的整體關系，也可得到最優響應值。

以預實驗中篩選到的葡萄糖，硫酸銨，硫代硫酸鈉以及酵母粉作為重要影響因素，取葡萄糖質量濃度38～46 g/L，硫酸銨質量濃度7～9 g/L，酵母粉質量濃度5～7 g/L，硫代硫酸鈉質量濃度5～7 g/L(表1)。

表1 Box-Behnken Design參數設計取值Table 1 The parameter values designed in Box-Behnken Design

以Box-Behnken設計(BBD)制定實驗方案，以帶有交互項的二次項模型進行擬合，擬合如公式(1)所示：

(1)

式中:Y表示L-Cys的產量，g/L；A0表示模型截距；Bi是一次項線性因子系數；Bii是二次項線性因子系數；Bij是交互項線性因子系數；Xi、Xj是每個變量的水平。

1.4 分析方法

通過用紫外分光光度計檢測OD600來表示細胞生長情況。發酵液中的葡萄糖濃度使用DNS法進行定量[21]。乙酸等常見有機酸使用高效液相色譜系統測定[8]。L-Cys和(L-Cys)2的含量通過超高壓高效液相色譜系統并配有C18反相色譜柱進行檢測[22]，將兩者的總含量認為是L-Cys含量[18]。無特殊說明，所有樣品均進行3次生物學重復，并選用平均值作為檢測值。

2 結果與分析

2.1 基于響應面的L-Cys優化結果

2.1.1 影響L-Cys產量的因素分析

Box-Behnken Design的結果如表2所示。表3顯示模型(P<0.05)有足夠的精度來預測L-Cys的產量，該模型下的失擬項的均方為0.014 2，在一定程度上表明預測值與實際值在允許偏差的范圍內，另外，模型的F值為18.453，表明實驗結果足夠顯著，在統計學上有分析意義。

表2 Box-Behnken Design的結果 單位：g/L

表3 Box-Behnken Design結果的統計學分析Table 3 Statistical analysis of Box-Behnken Design results

2.1.2 基于響應面法的回歸分析

將29個組合實驗結果應用多元回歸分析，建立回歸分析方程式：

L-Cys=+3.80-8.333E-003A-0.043B+0.23C+5.000E-003D-5.000E-003AB-5.000E-003AC-0.21AD+0.11BC+0.012BD+0.17CD-0.47A2-0.14B2-0.16C2-0.24D2

通過設置方程式的偏導數可以計算響應值L-Cys的產量最大下的培養條件，具體表示為葡萄糖(42.69 g/L)、硫酸銨(7.77 g/L)、酵母粉(6.53 g/L)、硫代硫酸鈉(6.22 g/L)，其他成分：蛋白胨(1 g/L)、KH2PO4(1 g/L)、Na2HPO4·10H2O(2.5 g/L)、金屬鹽溶液(1 mL/L)。該條件下理論L-Cys的產量為3.74 g/L，實際發酵結果為3.85 g/L，兩者結果吻合度較高，證實了模型預測的準確性和可靠性。

圖1-a揭示了葡萄糖和硫酸銨影響L-Cys產量的變化過程，隨著兩者質量濃度在其范圍內升高，響應值L-Cys質量濃度表現為先上升再下降的趨勢，并且無明顯的傾斜。這種趨勢在圖1-b～圖1-d中也有類似體現。在圖1-d探究硫酸銨和酵母粉對L-Cys的影響中，圖形顯示等高線向低水平的酵母粉方向傾斜，表明在低水平的酵母粉濃度下，酵母粉成為其主要的影響L-Cys產量的因素，酵母粉成為此時的主要限制條件。類似的現象也可以在圖1-e和圖1-f中顯示。

2.2 在2 L發酵罐上的放大

根據搖瓶結果進行發酵放大，在罐上發酵的結果并沒有如搖瓶中明顯提升。通過發酵測試，發現高濃度的葡萄糖會對菌體生長產生一定抑制，同時發現菌體在罐上對硫源和氮源的利用能力進一步提升，對培養基進行適當優化，將葡萄糖質量濃度降低至30 g/L，提升硫酸銨和硫代硫酸鈉質量濃度均至10 g/L，酵母粉和蛋白胨的添加量參考LB培養基，分別為5 g/L和10 g/L，再進行發酵放大。

2.2.1 發酵溫度的優化

發酵測試了不同發酵溫度下的L-Cys發酵過程特性，結果如圖2所示。從發酵過程曲線中可以看出，溫度是影響發酵結果的重要因素，26 ℃是生產L-Cys最適溫度。總體上來說，在研究范圍內，發酵溫度越高，菌株產L-Cys的時間越提前；但當溫度過低時，較低的發酵溫度會影響菌株的正常生長并延緩發酵過程[23]。本研究中，當發酵溫度低于26 ℃時，L-Cys 產量大幅下降，故選擇26 ℃作為發酵最適溫度，此時L-Cys產量可達6.13 g/L。

a-葡萄糖和硫酸銨對L-Cys產量影響；b-葡萄糖和酵母粉對L-Cys產量影響；c-葡萄糖和硫代硫酸鈉對L-Cys產量影響；d-硫酸銨和酵母粉對L-Cys產量影響；e-硫酸銨和硫代硫酸鈉對L-Cys產量影響；f-酵母粉和硫代硫酸鈉對L-Cys產量影響圖1 不同因素交互作用對L-Cys產量影響的響應面圖Fig.1 Effects of different factors on L-Cys yield in response surface studies

圖2 不同溫度對L-Cys發酵過程的影響Fig.2 The effects of different temperatures on L-Cys production

2.2.2 外源物質的添加

在氨基酸發酵過程中，菌株一方面會自身合成所需要的營養物質，另一方面會從外部攝取。當營養物質自身合成困難或者無法合成時，外源添加是一個很好的添加策略[24-25]。故嘗試在罐上進行外源物質的添加，提高菌株發酵產L-Cys的能力。

2.2.2.1 甜菜堿的添加

甜菜堿是一種生物堿，化學名稱為1-羧基-N,N,N-三甲氨基乙內酯，化學結構與氨基酸相似，屬于季銨堿類物質，且廣泛存在于動植物體內。據報道，甜菜堿可以調節細胞滲透壓，保護細胞[26]。

發酵結果如圖3所示，甜菜堿的添加對發酵來說有一定的作用。在添加2 g/L的甜菜堿之后，產量能夠達到7.12 g/L，相比于不添加的產量6.13 g/L來說，提高了16.2%。由于L-Cys具有一定細胞毒性，甜菜堿的添加可以調節細胞滲透壓從而保護細胞，使更多的菌株在平臺期進行L-Cys合成(添加甜菜堿的發酵過程中菌株OD600達到20的時間在30 h左右，相比于不添加甜菜堿的60 h提前了30 h左右)，進而提高了L-Cys發酵產量。

a-不添加甜菜堿；b-添加甜菜堿圖3 外源添加2 g/L的甜菜堿對發酵的影響Fig.3 The effects of 2 g/L betaine addition on L-Cys fermentation

2.2.2.2 氨基酸的添加

氨基酸發酵過程中的多種菌株均為營養缺陷型菌株，因此氨基酸的外源添加有時候能夠起到加強主路代謝，增強產物合成的作用。有研究表明，添加其他必需氨基酸對目標產物氨基酸的發酵會有促進作用[27]。

如圖4所示，通過對比實驗發現罐上添加1 g/L蛋氨酸、1 g/L蘇氨酸以及1 g/L異亮氨酸后，L-Cys發酵產量能達到10.25 g/L，與不添加氨基酸相比(7.12 g/L)提高了43.9 %。從發酵結果可以看出，添加氨基酸有效提高了發酵過程中菌體的OD600，在培養基自身具有氨基酸時，菌株會攝取環境中的氨基酸代替自身合成，結余的物質、能量可能用于細菌生長，因此平臺期OD600有一定程度的提高，在這種情況下，菌株更多的利用自身代謝進行產物發酵，從而提升發酵產量[28]。

a-不添加3種氨基酸；b-添加3種氨基酸圖4 外源添加1 g/L蛋氨酸，1 g/L蘇氨酸，1 g/L異亮氨酸對L-Cys發酵的影響Fig.4 The effects of adding 1 g/L methionine, 1 g/L threonine, and 1 g/L isoleucine together on L-Cys fermentation

2.3 優化前后相關參數的對比

文章中主要采用了響應面的培養基優化方法，以及發酵罐中外源添加的發酵策略，從一開始的發酵48 h產量為1.43 g/L，優化到發酵罐最終放大的結果為47 h產10.25 g/LL-Cys。對其中相關參數計算后發現，優化后的硫轉化效率，糖酸轉化率以及單位時間產量均有所提升。且優化培養基成分后，丙酮酸和乙酸含量均下降。其中，丙酮酸為關鍵中間代謝產物，一方面，其為糖酵解途徑產物，維持細胞的正常代謝生長，另一方面，在保證細胞正常代謝情況下，丙酮酸積累的下降有利于碳源流向L-Cys合成，從而有利于L-Cys生產。乙酸作為大腸桿菌生產中最常見的副產物，其濃度過高會抑制細胞的正常代謝，優化后乙酸含量下降，降低了乙酸對細胞生長的抑制作用。相關參數輔助說明了優化發酵條件后，使得更多的碳源和硫源流向L-Cys的合成，從而提高L-Cys的產量。具體參數變化見表4。

表4 優化前后的L-Cys發酵結果Table 4 The results of L-Cys production before and after optimization

3 結論

在本研究中，利用響應面分析方法，確定培養基成分為葡萄糖(42.69 g/L)、硫酸銨(7.77 g/L)、酵母粉(6.53 g/L)、硫代硫酸鈉(6.22 g/L)、蛋白胨(1 g/L)、KH2PO4(1 g/L)、Na2HPO4·10H2O (2.5 g/L)、金屬鹽溶液(1 mL/L)，維生素B1(5 mg/L)，CaCO3(10 g/L)，初始pH 7.0。優化后搖瓶發酵L-Cys的產量較優化前有大幅提高，達到3.85 g/L，較優化前的1.43 g/L提高了169%；在2 L的發酵罐上，結合不同的外源添加策略，最終L-Cys產量在47 h最高，達到10.25 g/L，為實現L-Cys的工業化生產奠定了基礎。