開菲爾源白地霉包埋姜黃素工藝及穩定性研究

武月冉，包暄，尹鑫濤，馮雪，董明盛

(南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095)

姜黃素是一種天然來源的多酚類化合物，主要從姜黃類植物的根莖中提取得到，目前作為調味料和食用色素被廣泛應用于食品工業中[1]。大量研究表明，姜黃素具有抗炎癥[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]等生理活性，同時對糖尿病[5]、人體缺陷免疫綜合征[6]、心肌病[7]等疾病都有顯著的預防和治療效果。然而，姜黃素在水中溶解度極低[8]，在光照、加熱和化學處理時穩定性差，易發生變性和降解[9]，這都造成了姜黃素的生物利用度較低，難以在實際應用中發揮其生理功能。因此，如何提高姜黃素的穩定性和生物利用度成為了當今的研究熱點。

為解決上述問題，微膠囊包埋技術被廣泛應用于姜黃素等功能活性物質的包埋和遞送。常見的包埋載體主要包括脂質體、高分子納米顆粒、環糊精、納米乳液等[10]，它們通常為食品級運載體系，具有來源廣泛、無毒副作用、致敏性低、生物相容性高等優點[11]。更重要的是，包埋技術可以顯著改善姜黃素等生物活性物質的水溶性和環境穩定性[12]，提高生物利用度，保護其免受體內的酶和其他物質的分解，并實現靶向運輸和可控性釋放[13]，最大限度地發揮生物活性功能。然而，這些包埋載體的制備過程較為復雜，且常常涉及到化學試劑(如戊二醛、丙酮等)的添加和高溫處理[14-15]，在安全性和經濟性方面存在一定的局限性。

與上述包埋載體相比，酵母細胞基包埋載體在安全性、經濟性和包埋效果方面都具有顯著的優勢[16]。同時，酵母包埋材料可以顯著提高包埋物質的穩定性，防止活性物質在食品加工過程中發生分解，這主要得益于酵母細胞所具有的結構，即堅固的細胞壁結構、具有選擇透過性的細胞膜和包含抗氧化成分的細胞質[17]。白地霉是一種性狀類似酵母的的耐酸性霉菌，來源廣泛且環境適應能力較強[18]，被廣泛應用于奶酪發酵、污水治理和動物飼養等領域[19-21]。白地霉和酵母菌在結構和功能方面的相似性，以及開菲爾源白地霉獨特的益生功能，使其成為了一種理想的姜黃素包埋材料，在功能性食品開發和疾病預防治療方面有著廣闊的應用前景，但目前仍然沒有關于白地霉在姜黃素包埋方面的研究。

本研究選用實驗室保藏的1株從西藏開菲爾中篩選出的白地霉(GeotrichumcandidumLG-8)作為包埋載體，確定了最佳包埋條件，表征了其對姜黃素的包埋能力，并探究了包埋產物的穩定性，旨在為提高姜黃素的穩定性和生物利用度提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素(分析純)，上海麥克林生物公司；白地霉,開菲爾源白地霉LG-8(G.candidumLG-8)，保藏于本實驗室中；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、甘油(分析純)、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、PBS緩沖液(pH 7)，上海阿拉丁生化試劑有限公司；實驗用水均為純水。

1.2 儀器與設備

LC-85L無油隔膜式真空泵，上海力辰儀器科技有限公司；μQuant微孔板掃描分光光度計，美國博騰儀器有限公司；Leica TCSSP8STED超高分辨共聚焦顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司；UltraVIEW VoX活細胞高速激光共聚焦實時成像系統，美國鉑金埃爾默公司；JEM2100透射電子顯微鏡，日本電子株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 白地霉包埋載體的制備

取甘油管保藏的白地霉，經酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養基活化24 h后，以10%的接種量進行18 h二次活化和20 h擴大培養。離心得到白地霉菌體，用純水洗滌3次，得到的菌泥為白地霉包埋載體，密封貯存在4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 白地霉-姜黃素包埋產物的制備

參考YOUNG等[22]的方法，白地霉-姜黃素包埋產物(G.candidum-curcumin encapsulation products, GCEPs)的制備采用真空包埋法。稱取1 g(濕重)白地霉菌泥加入5 mL乙醇溶液中制成懸濁液,并加入1 mL 1 mg/mL的姜黃素乙醇溶液，以90%的真空度對混合溶液進行抽真空處理，離心得到的沉淀即GCEPs。

1.3.3 GCEPs中姜黃素的提取與含量測定

GCEPs中的姜黃素通過超聲處理的方法提取得到，并通過分光光度分析法計算姜黃素含量。將1 g GCEPs(濕重)加入5 mL無水乙醇中制成懸濁液，超聲處理10 min使GCEPs中的姜黃素溶解于無水乙醇中，離心后測量上清液在425 nm處的吸光值，并通過姜黃素乙醇溶液的標準曲線回歸方程計算GCEPs中的姜黃素含量。

1.3.4 包埋率的計算

包埋率被用作表征載體包埋能力的指標，具體是指姜黃素包埋量與姜黃素初始添加量的比值，計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Vf，從GCEPs中提取得到的姜黃素溶液體積，5 mL；V0，姜黃素溶液初始添加體積，1 mL；ρf，從GCEPs中提取得到的姜黃素溶液質量濃度，mg/mL；ρ0，姜黃素溶液初始添加質量濃度，1 mg/mL。

1.3.5 包埋條件的優化

單因素實驗：以包埋率為指標，探究包埋環境pH、包埋介質乙醇體積分數和真空處理時間對白地霉包埋姜黃素能力的影響。

包埋環境pH：稱取1 g(濕重)白地霉菌泥，加入5 mL 體積分數為35%的乙醇溶液中制成懸濁液，調節懸濁液pH分別為2、4、6、8、10、12，加入1 mL 1 mg/mL的姜黃素溶液，真空處理1 min，計算包埋率。

包埋介質乙醇體積分數：稱取1 g(濕重)白地霉菌泥，加入5 mL體積分數分別為0%、10%、20%、30%、40%、50%的乙醇溶液中制成懸濁液，調節懸濁液pH為7，加入1 mL 1 mg/mL的姜黃素溶液，真空處理1 min，計算包埋率。

真空處理時間：稱取1 g(濕重)白地霉菌泥，加入到5 mL體積分數為35%的乙醇溶液中制成懸濁液，調節懸濁液pH為7，加入1 mL 1 mg/mL的姜黃素溶液，真空處理時間分別為0.5、1、5、10、20、30 min，計算包埋率。

響應曲面優化：基于上述單因素實驗的結果，以包埋率為指標，設計3因素3水平的響應曲面實驗，探究最佳包埋條件。各因素和水平編碼見表1。

表1 響應曲面因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface

1.3.6 GCEPs的表征

1.3.6.1 激光共聚焦顯微鏡觀察

姜黃素可以在425 nm處產生綠色熒光，無需進行二次染色。用于制片的樣品分別為：白地霉包埋載體、GCEPs和乙醇提取姜黃素處理后的GCEPs。制片方法為：取1 g(濕重)上述樣品，加入5 mL PBS緩沖液(pH 7)中制成懸濁液，吸取少量懸濁液滴在載玻片上制成樣片，蓋好蓋玻片并避光保存，防止發生熒光淬滅。將樣片放置于無激發光狀態下和425 nm激發光下分別拍攝照片，再將2張圖片重合。

1.3.6.2 透射電鏡觀察

用于透射電鏡的樣品為白地霉包埋載體和GCEPs。制樣方法為：將上述樣品用PBS緩沖液(pH 7)清洗3次后，用體積分數為2.5%的戊二醛固定12 h，脫水處理并制備切片，再用檸檬酸鉛和醋酸鈾對超薄切片進行染色后，用透射電鏡進行觀察。

1.3.7 GCEPs的穩定性分析

1.3.7.1 貯存時間對GCEPs穩定性的影響

將1 g(濕重)GCEPs加入10 mL PBS緩沖液(pH 7)中制成懸濁液，靜置避光保存0、1、5、10、20、30 d后，參考1.3.3中的方法提取出GCEPs中殘留的姜黃素，并計算GCEPs中姜黃素的保留率。同時，未經過包埋的游離姜黃素在PBS緩沖液(pH 7)中的保留情況也被研究，并用來與GCEPs中的姜黃素比較。姜黃素保留率的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A1，不同處理前從GCEPs中提取出的姜黃素在425 nm處的吸光值；A2，不同處理后從GCEPs中提取出的姜黃素在425 nm處的吸光值。

1.3.7.2 pH對GCEPs穩定性的影響

將1 g(濕重)GCEPs加入10 mL PBS緩沖液(pH 7)中制成懸濁液，調節pH分別為2、4、6、8、10、12，靜置避光保存0.5、1、3、5 h后，參考1.3.3中的方法提取出GCEPs中殘留的姜黃素，并計算GCEPs中姜黃素的保留率，計算方法參考公式(2)。

1.4 數據處理

所有實驗均進行3次重復，實驗數據以平均數±標準差的形式表示；運用Origin 2021軟件作圖；運用SAS和Design Expert 8.0.6進行顯著性統計分析，P<0.05 表示存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 包埋條件的優化

2.1.1 單因素實驗

包埋環境pH、包埋介質乙醇體積分數和真空處理時間對姜黃素包埋率的影響如圖1所示。總體來看，與堿性環境相比，白地霉在酸性環境中對姜黃素的包埋能力更強。當包埋環境為酸性時，隨著酸性的減弱，包埋率逐漸增加，在pH為6時達到最大值，為(39.54±0.87)%。之后隨著堿性增強，包埋率顯著下降(P<0.05)，pH 12時包埋率低于1%。這主要是由于白地霉在弱酸性環境中活性更強，對堿性環境更為敏感[23]，當包埋環境過酸或過堿時，白地霉細胞的活性受到影響，使其對姜黃素的包埋效率下降。同時，姜黃素在酸性環境中的穩定性較強，而在堿性環境中極易發生降解[24]。隨著包埋介質乙醇體積分數的增加，包埋率先上升后下降，在乙醇體積分數為40%時達到最大值，包埋率為(44.38±1.39)%。YOUNG等[22]的研究中也具有相似的結果：以釀酒酵母細胞為姜黃素包埋載體并使用真空包埋法，當包埋介質乙醇體積分數為35%時包埋率最高。隨著真空處理時間的增加，白地霉的包埋率呈顯著上升趨勢(P<0.05)，當真空處理時間為20 min時，白地霉對姜黃素的包埋能力趨于飽和，包埋率為(47.34±1.35)%。此后，隨著真空處理時間的繼續增加，包埋率顯著下降(P<0.05)，這是由于較長時間的真空處理導致白地霉細胞受損，包埋能力下降。

a-不同包埋環境pH的包埋率；b-不同包埋介質乙醇體積分數的包埋率；c-不同真空處理時間的包埋率圖1 不同因素對姜黃素包埋率的影響Fig.1 The influence of different factors on curcumin encapsulation efficiency注：同組不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.1.2 響應曲面優化

利用Design Expert 8.0.6軟件，按照表1的編碼水平設計17組實驗，結果見表2。得到的三元二次回歸方程為：Y=45.10-7.36A+4.05B+6.54C-1.90AB+2.02AC+1.19BC-13.87A2-8.02B2+2.42C2-0.94ABC

表2 響應曲面實驗結果Table 2 Results of response surface experiments

通過表3的方差分析結果可知，此回歸模型極顯著(P<0.01)，模型R2=0.987 9，說明模型擬合程度高，可用于預測白地霉包埋姜黃素的最佳條件。另外，根據F值可以看出，各因素對姜黃素包埋率影響的主次順序為：包埋環境pH(A)>包埋介質乙醇體積分數(B)>真空處理時間(C)。根據P值可以看出，A和BC對包埋率的影響極顯著(P<0.01)，B、C和B2對包埋率有顯著影響(P<0.05)。

表3 方差分析結果Table 3 Results of variance analysis

通過Design Expert 8.0.6軟件分析可以得到，最佳包埋條件為：包埋環境pH 6.64，包埋介質乙醇體積分數46.84%，真空處理時間18.38 min，此條件下得到的理論包埋率為56.34%。結合實際操作情況，將最佳包埋條件調整為：包埋環境pH 6.5，包埋介質乙醇體積分數45%，真空處理時間20 min，進行3次重復實驗，得到的實際包埋率為(54.12±1.07)%，與理論值接近，說明該回歸模型擬合度高，可用于優化白地霉對姜黃素的包埋條件。

2.2 GCEPs的表征

2.2.1 激光共聚焦顯微鏡分析

圖2為白地霉包埋載體、GCEPs和乙醇提取姜黃素處理后的GCEPs的激光共聚焦顯微鏡圖像。在明場下，白地霉的輪廓清晰可見，呈圓柱形或棒狀，且在熒光場未看到白地霉，說明白地霉自身沒有熒光性質。GCEPs的圖像中，在熒光條件下可以觀察到姜黃素發出的明顯綠色熒光，同時，從合成圖像可以看出姜黃素在白地霉包埋載體中分布均勻，說明真空包埋法可以用于制備GCEPs，且保持白地霉包埋載體自身的完整性。用乙醇提取GCEPs中的姜黃素后，白地霉包埋載體的形態未發生明顯變化，但熒光條件下觀察到的熒光強度明顯減弱，表明包埋在GCEPs中的大部分姜黃素都可以通過乙醇處理的方法提取得到，用于姜黃素包埋率的計算。

a-白地霉包埋載體；b-GCEPs；c-乙醇提取姜黃素處理后的GCEPs圖2 白地霉包埋載體和乙醇處理前后的GCEPs的激光共聚焦顯微鏡圖像Fig.2 CLSM images of G.candidum and GCEPs before and after extraction treatment by ethanol

2.2.2 透射電鏡分析

透射電鏡的結果如圖3所示。觀察可知，白地霉的細胞質均勻分布在細胞中，且細胞壁較厚，共有3層，由外到內分別為甘露聚糖、蛋白質分子和葡聚糖[25]。經過真空包埋處理后，白地霉的細胞形態未發生明顯變化，切面仍然保持圓形或橢圓形，說明真空包埋法不會對白地霉的細胞形態造成破壞。同時，可以看到姜黃素均勻分散在細胞質中，與激光共聚焦顯微鏡觀察的結果一致，驗證了白地霉作為姜黃素包埋載體的可行性。

a-白地霉包埋載體;b-GCEPs圖3 白地霉包埋載體和GCEPs的透射電鏡圖像Fig.3 TEM images of G.candidum and GCEPs

2.3 GCEPs的穩定性分析

2.3.1 貯存時間對GCEPs穩定性的影響

隨著貯存時間的增加，GCEPs中的姜黃素有一定的損失，但總體來看具有較強的穩定性。在室溫條件下避光貯存1 d后，GCEPs中大部分的姜黃素被保留，保留率高達(94.69±1.93)%；隨著貯存時間的增加，包埋產物中的姜黃素緩慢流失；30 d時，GCEPs的姜黃素保留率為(70.41±1.17)%，仍處于較高保留水平。然而，未包埋的游離姜黃素表現出了極差的穩定性，僅在1 d時間內就損失了約90%；10 d后，超過99%的姜黃素變性分解。馮甜華[26]的實驗結果同樣也證實了未包埋姜黃素穩定性差這一特點：自然條件下貯存72 h后，游離姜黃素的殘量百分比僅有(1.94±0.58)%。綜上所述，白地霉的包埋可以顯著提高姜黃素的貯存穩定性。

圖4 不同貯存時間下GCEPs中的姜黃素和游離姜黃素的保留率Fig.4 Retention rates of curcumin in GCEPs and free curcumin at different storage time

2.3.2 pH對GCEPs穩定性的影響

姜黃素在生理pH條件下極不穩定，在堿性環境中易發生變性和降解，這都導致了姜黃素的生物利用度極低[27]。因此，探究不同pH條件下GCEPs中姜黃素的穩定性對提高姜黃素的生物利用度具有重要意義。根據圖5可知，在酸性和弱堿性環境中，GCEPs中的姜黃素可以在長時間內保持穩定，當pH分別為2、4、6、8時，GCEPs中的姜黃素在5 h后的保留率分別為(93.12±0.56)%、(93.87±0.19)%、(91.08±0.74)%和(87.17±2.42)%，均處于較高水平。然而，pH為10和12時，5 h后GCEPs中的姜黃素保留率僅有(41.82±0.56)%和(29.18±0.56)%，與酸性和弱堿性環境的保留率相比發生顯著降低(P<0.05)。因此，GCEPs中的姜黃素在酸性、中性和弱堿性環境下可以保持較好的穩定性，但強堿性環境會加速包埋姜黃素的變性與降解。

圖5 不同pH條件下GCEPs中姜黃素的保留率隨時間的變化情況Fig.5 Retention rates of curcumin in GCEPs at different pH conditions for various incubation time

3 結論

開菲爾源白地霉(G.candidumLG-8)作為包埋材料，可以有效地包埋姜黃素，在最佳包埋條件下，即包埋環境pH 6.5，包埋介質乙醇體積分數45%，真空處理時間20 min，包埋率高達(54.12±1.07)%，具有優秀的包埋性能。同時，經過白地霉包埋后，姜黃素的貯存穩定性和pH穩定性顯著增強，尤其是在酸性和弱堿性環境中的穩定性。本文探究了開菲爾源白地霉作為姜黃素包埋載體的可行性，為提高姜黃素的穩定性和生物利用度提供了新思路。