可溶性E-鈣黏蛋白相關的氧化應激在慢性乙型肝炎患者中的臨床研究

丁惠惠，陳 紅，丁小娟，杜艷娥，王 波

(重慶醫科大學附屬第二醫院檢驗科，重慶 400010)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是人類最常見的傳染病之一。據報道，每年約有100萬人病亡于HBV相關疾病，如HBV相關癌癥和終末期肝病[1]。因此，HBV感染仍然是一個嚴重的全球健康問題，但CHB病毒感染的確切機制仍不清楚。

在過去的幾十年里，越來越多的證據表明活性氧(ROS)(包括超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫和單線態氧)作為重要的調節因子，促進了HBV與肝臟疾病的發生和發展。研究表明，HBV編碼的X蛋白誘導ROS產生，通過Ⅲ類磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)(VPS34)/beclin-1和c-Jun N-末端激酶信號途徑在HBV復制中起著至關重要的作用[2]。迄今為止，氧化應激在HBV相關疾病中的病理生理相關性尚有待闡明，未來的研究需要關注ROS在HBV相關病理過程中的作用。

E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是一種跨膜糖蛋白，主要存在于上皮細胞中，是一種已知的侵襲/轉移抑制因子。目前，研究證據表明，E-cadherin可能是一個信號轉導平臺。E-cadherin可被多種蛋白酶分解，包括基質金屬蛋白酶、激肽釋放酶7和纖溶酶，從而導致細胞外N-末端可溶性片段(80 kDa)的釋放，稱為可溶性E-鈣黏蛋白(sE-cadherin)[3]。長期以來，人們認為sE-cadherin僅作為非功能性肽發揮作用。越來越清楚的是，sE-cadherin可以啟動各種信號級聯，最終導致病理生理反應。WANG等[4]的最新研究表明，sE-cadherin可能是導致HBV相關肝病發生和發展的細胞因子之一。有研究表明，與健康人相比，前列腺癌、黑色素瘤、胃癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、結直腸癌和肝癌患者的sE-cadherin水平要高得多[5]，但sE-cadherin在慢性乙型肝炎(CHB)中作用的分子機制尚不清楚。

本研究主要評估CHB患者血清sE-cadherin水平和氧化/抗氧化能力的變化，從而更好地了解sE-cadherin與CHB患者氧化應激狀態之間的相互作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年7月至2018年4月重慶醫科大學第二附屬醫院在獲得書面知情同意后，招募HBV陽性或陰性的受試者作為研究對象。血清樣本包括105例CHB患者、112例非活動性HBV攜帶者和109例健康人[HBV、丙型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒(HIV)感染呈陰性]。根據《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)[6]確定CHB患者和非活動性HBV攜帶者，在本研究登記前6個月內未接受抗病毒治療。在此研究中，作者也使用包括磁共振成像和計算機斷層掃描的成像技術來識別CHB和其他肝臟疾病。本研究經重慶醫科大學第二附屬醫院倫理委員會批準，按照赫爾辛基宣言的原則進行。

1.2方法

1.2.1血清采集 采集人外周血，室溫保存30 min凝固，轉速3 000 r/min離心10 min。立即分離血清上清液并在-80 ℃下保存。

1.2.2肝功能試驗 血清樣品中的肝酶水平[谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)]根據制造商的說明，使用肝功能檢測試劑盒(中國四川邁克)進行定量。

1.2.3乙型肝炎病毒DNA定量 采用CFX-Connect實時PCR檢測系統(CA)檢測血清HBV-DNA水平，一式三份進行檢測，程序遵循制造商的說明。

1.2.4sE-cadherin、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的酶聯免疫吸附測定 用人血清sE-cadherin雙酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(R&D系統，MN)測定血清sE-cadherin水平。用人GSH-ELISA試劑盒(EIAAB,中國武漢)檢測血清GSH濃度。用人MDA ELISA試劑盒(EIAAB，中國武漢)測定血清MDA含量。所有血清樣本按照制造商的說明一式三份進行檢測，平均值用于統計分析。

1.2.5超氧化物歧化酶(SOD)的測定 采用SOD檢測試劑盒(WST-1法，南京建成生物工程研究所)測定血清SOD濃度。

1.2.6NADPH氧化酶2(NOX2)的ELISA測定 采用ELISA法檢測可溶性NADPH NOX2肽的水平。在此研究中調整了該方案，以測量乙型肝炎患者的血清NOX2濃度[7]。具體操作步驟：(1)每個抗NOX2抗體包被良好(antiNOX2/gp91phox抗體)。(2)加入100 μL血清樣品或標準品，搖動時在室溫下孵育2 h。(3)清洗3次后，在每個孔中加入100 μL稀釋的辣根過氧化物酶結合檢測抗體(Abcam)，隨后在室溫下孵育1 h，同時輕輕攪拌。(4)再次抽吸和清洗每個孔3次，所有孔添加100 μL酶底物溶液，然后在室溫下孵育20 min。(5)向所有孔中加入50 μL的1 mol/L硫酸溶液(H2SO4)，即停止溶液。(6)利用Multiskan-FC微板閱讀器(MA)在450 nm處分析吸光度。

1.2.7總抗氧化能力(TAC)和總氧化活性(TOA)的測定 用自動測定技術測定TAC和TOA[8]。TAC和TOA的結果分別表示為mmol Trolox Eq/L和μmol H2O2Eq/L。

2 結 果

2.1健康人和患者血清sE-cadherin水平 初始診斷時受試者的臨床特征見表1。與健康人相比，HBV相關疾病患者的血清sE-cadherin水平明顯升高。乙型肝炎包膜抗原(HBeAg)陰性(-)的CHB患者(平均值566.31 pg/mL)和HBeAg陽性(+)的CHB患者(平均值672.55 pg/mL)的血清sE-cadherin濃度明顯高于健康人(平均值：309.54 pg/mL；P<0.01)。健康人和非活動性HBV攜帶者之間沒有明顯的變化。HBeAg陽性CHB患者的血清sE-cadherin水平明顯高于HBeAg陰性CHB患者，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表1 本研究受試者的臨床特征

表2 各種人血清樣本中sE-cadherin水平間相關性

2.2血清sE-cadherin水平與肝酶標志物相關性 HBeAg(-)和HBeAg(+)CHB患者的血清ALT和AST水平明顯高于健康人。而且HBeAg(-)CHB患者的血清ALT和AST水平明顯低于HBeAg(+)CHB患者。此外，HBeAg陰性CHB患者的血清sE-cadherin水平與ALT之間存在顯著相關性(P<0.01)，與AST之間存在顯著相關性。HBeAg(+)CHB患者的血清sE-cadherin水平與ALT之間存在顯著相關性(P<0.01)，與AST之間存在顯著相關性(P<0.01)。見表3。

表3 血清sE-cadherin水平與ALT和AST的相關性

2.3血清sE-cadherin水平與抗氧化能力相關性 CHB患者的血清GSH和SOD水平與健康人相比明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。而HBeAg(-)和HBeAg(+)的CHB患者之間無顯著差異(P>0.05)。在CHB患者中，血清sE-cadherin和TAC之間呈顯著負相關(P<0.01)。在CHB患者中觀察到血清sE-cadherin和抗氧化酶，包括GSH和SOD之間呈強負相關(P<0.01)。見表4。

表4 血清sE-cadherin水平與抗氧化標志物的相關性

2.4血清sE-cadherin水平與氧化應激標志物的關系 CHB患者血清TOA的平均水平與血清sE-cadherin水平的增加成正比(P<0.05)。CHB患者的血清sE-cadherin和氧化標記物(包括NOX2和MDA)水平的增加呈正相關(P<0.01)。見表5。

表5 血清sE-cadherin水平與氧化應激標志物的相關性

3 討 論

血清sE-cadherin在上皮細胞行為和組織形態發生/重塑中起著重要作用。在不同的病理條件下，血清sE-cadherin的胞外段可以被多種蛋白酶切割，血清sE-cadherin水平的升高與癌癥、傳染病和炎癥相關疾病有關，血清sE-cadherin還作為一個關鍵的炎癥信號節點[9]。越來越多的證據表明，血清sE-cadherin水平的升高可能與全身炎癥反應的嚴重程度及多器官衰竭有關。本研究表明，血清sE-cadherin可能是HBV相關疾病進展的一個關鍵生物標志物。

本研究表明，與健康人相比，CHB患者的血清sE-cadherin濃度顯著增強。在HBeAg(-)和HBeAg(+)的CHB患者中，ALT和AST活性與血清sE-cadherin呈顯著正相關。本研究結果顯示，血清sE-cadherin可以作為一個重要的角色，有助于CHB的發生和發展。

此外，在非活動性HBV攜帶者和健康個體之間未觀察到明顯的變化。這一現象可以解釋為：(1)血清sE-cadherin水平的升高與HBV相關疾病的發生有關；(2)非活動性HBV攜帶者的大多數炎癥標志物和免疫反應通常是正常的。

迄今為止，HBV介導的ROS可導致慢性感染和炎癥，從而導致嚴重肝病[1]。升高的血清sE-cadherin水平表示完整的E-cadherin分裂增加，繼發于蛋白酶活性上調或活化中性粒細胞釋放自由基導致組織結構和功能喪失。據報道，ROS降低了血清sE-cadherin的表達[10]。因此，血清sE-cadherin是否是CHB中的氧化應激標志物仍有待進一步確定。

本研究表明：(1)CHB患者的TAC、GSH和SOD水平低于健康人；(2)HBeAg(-)和HBeAg(+)CHB患者的血清sE-cadherin水平與TAC、GSH和SOD呈顯著負相關。目前，很少有研究評估HBV中血清sE-cadherin與氧化應激之間的相互作用。本研究結果顯示血清sE-cadherin水平升高的CHB患者中，抗氧化水平顯著降低。

為了解CHB患者血清sE-cadherin變化的認識，進一步研究血清sE-cadherin水平與氧化標志物之間的關系。本研究顯示，健康人的血清TOA、NOX2和MDA水平低于CHB患者；血清氧化標記物與血清sE-cadherin濃度呈正相關。本研究中，CHB患者的MDA水平比健康人更高，并且與血清sE-cadherin水平呈正相關來驗證和擴展這些結果。本研究提示，血清sE-cadherin水平的升高，結合NOX2水平，可能是HBV感染慢性進展中一個有用的新氧化標志物。

綜上所述，本研究提供了新的臨床觀點，即血清sE-cadherin可能是反映HBV感染發展和進展中炎癥和氧化應激的一個新的候選生物標記物。因此，需要進一步的縱向和前瞻性研究，以引入更多與HBV相關的肝硬化和HCC患者，評估血清sE-cadherin反映氧化應激的實用價值，并進一步闡明這些患者的脫落機制和血清sE-cadherin的病理生理學作用。