結腸癌患者BCL6B基因啟動子區域甲基化檢測結果分析

白雪，杜井峰

廣東省深圳市深圳大學總醫院消化內科，廣東深圳518000

結腸癌是常發于直腸與乙狀結腸交接處的消化道惡性腫瘤，以中老年患者居多，雖有研究報道，家族遺傳、環境因素和生活習慣在一定程度上會影響腸胃健康，甚至導致消化道疾病，但是結腸癌具體的發病機制尚未明確[1-2]。抑癌基因是一種調節細胞增長分化、維持機體細胞穩定的、可抑制腫瘤細胞生長的基因，這類基因的突變、失活或缺失時會引起其內啟動子區域高甲基化，抑癌功能喪失會引起細胞惡性轉化導致腫瘤[3]。B細胞白血病/淋巴瘤6B（B-cell leukemia/lymphoma 6 member B,BCL6B）基因，位于17號染色體p13.1上，作為B細胞白血病/淋巴瘤6（B-cell leukemia/lymphoma 6,BCL6）家族一員具有抑制轉錄功能[3-4]。然而目前雖有研究報道稱，BCL6與胃癌的生長及其預后相關，但其對結腸癌患者的作用機制尚未明確[4]。故此，該研究方便選取2018年6月—2020年6月56例在該院接受治療的結腸癌患者進行分析，旨在探討結腸癌患者BCL6B基因啟動子區域甲基化情況，研究結腸癌發生及發展機制，以期為臨床預防結腸癌發病及其治療提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取在該院接受治療的56例結腸癌患者，以其術后切除的癌組織和配對的癌旁組織為標本進行研究。納入標準：①經病理檢查確診為結腸癌[5]；②男性34例，女性22例；③年齡44～80歲，平均（58.41±9.28）歲；④按TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期24例，Ⅲ、Ⅳ期32例；⑤有轉移33例，無轉移23例；⑥分化程度：高分化18例，中、低分化38例。排除標準：①已經或正在接受放化療者；②伴有其他臟器合并癥者；③精神障礙或其他不能配合治療的情況者。同時期選取同數量在該院做健康體檢的正常人，選取其腸鏡活檢的正常結腸黏膜組織對照研究。該研究符合醫學倫理，患者及家屬知情并同意。

1.2 方法

檢測所用試劑購自天根生化科技(北京)有限公司的聚合酶鏈式反應（PCR）試劑和石蠟包埋組織DNA提取試劑盒，以及深圳華大基因有限公司的去甲基化引物。BCL6B基因非甲基化引物序列為5'-TTTTGTTTTGG ATTTGTTATTTGGAGAGT-3'(上游)和5'-CTTAACCTCAACTCCTTTATCTAACCA-3'（下游）；甲基化引物序列為5'-CGTTTTGGATTCGTTATTTGGAGAGC-3'（上游）和5'-CTTAACCTCAACTCCTTTATCTAACCA-3'（下游）。反應條件:95℃預性5 min，95℃下40 s，60℃下45 s，72℃下40 s，共循環35個PCR，最后72℃退火5 min。每項檢測均設置陰性對照，甲基化引物擴增出條帶為陽性，其余記為陰性[6]。

1.3 觀察指標

觀察結腸癌患者臨床指標與BCL6B基因啟動子區域甲基化關系；正常結腸組織、癌細胞組織與癌旁細胞組織BCL6B基因啟動子區域甲基化情況（包括有無甲基化、甲基化陽性數量、甲基化率等）。

1.4 統計方法

采用SPSS 22.0統計學軟件處理數據，計數資料用[n(%)]表示，采用χ2檢驗，事后經Logistic回歸分析影響因素，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同患者BCL6B基因啟動子區域甲基化率比較

結腸癌患者不同性別及年齡之間BCL6B基因啟動子區域甲基化率比較,差異無統計學意義（P>0.05）；Ⅰ、Ⅱ期患者甲基化率（陽性）50.00%明顯低于Ⅲ、Ⅳ期患者甲基化率（陽性）81.25%；高分化患者甲基化率44.44%明顯低于中、低分化患者甲基化率78.95%；有發生淋巴轉移患者的甲基化率78.79%（陽性）84.85%明顯高于無淋巴轉移患者的甲基化率（陽性）43.48%，比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同患者BCL6B甲基化率比較[n(%)]

2.2 Logistic二次元分析影響BCL6B基因啟動子區域甲基化的因素

通過Logistic進一步分析，結果顯示，TNM分期、分化程度以及有無轉移均為BCL6B基因啟動子區域甲基化率的獨立影響因素（P＜0.05），見表2。

表2 Logistic二次元分析影響BCL6B基因啟動子區域甲基化的因素

2.3 正常結腸組織、結腸癌細胞系和結腸癌組織的BCL6B基因啟動子區域甲基化狀況比較

經PCR檢測，相關指標解讀為只能擴增出甲基化條帶的陽性對照（IVD），正常人外周血淋巴細胞陰性對照（NL），滅菌雙蒸水的空白對照（H2O），非甲基化條帶（U），甲基化條帶（M）。檢測結果如下：圖1a所示正常結腸組織的BCL6B未發現甲基化狀況；圖1b表示結腸癌細胞系甲基化狀況，其中RKO、HT29為完全甲基化；圖1c表示選取的56例結腸癌患者中BCL6B基因啟動子區域甲基化38例，甲基化率67.86%，見圖1。

圖1 不同組織的BCL6B甲基化狀況

3 討論

結腸癌在我國惡性腫瘤榜高居不下，近年來，盡管經濟條件、生活水平不斷提高，但我國結腸癌的發病率未見改善。隨著醫的進步，雖然對于結腸癌的治療效果有一定提高，但是目前臨床對結腸癌的具體發病機制仍未明確，因此，探究與其發生、發展相關的分子標志物，對于結腸癌的治療具有重要意義[4,7]。

近年來，隨著研究的推進，表觀遺傳學在基因相關調控中的作用愈發重要[8]。有研究表明，腫瘤細胞基因異常甲基化與患者的性別、年齡、TNM分期、分化程度及有無轉移等指標相關[9-10]。該研究表明，結腸癌組織BCL6B基因啟動子區域甲基化率在TNM分期、分化程度及有無轉移指標中相關；但與患者性別、年齡無關；且經Logistic回歸二次分析可知，TNM分期、分化程度以及有無淋巴轉移均可作為BCL6B基因啟動子區域甲基化率的獨立影響因素，這與鄒庚藝、陳笑等[9-10]觀點一致。

惡性腫瘤由于多種因素導致局部組織的細胞在基因水平上失去了正常調控，BCL6B基因與BCL6基因屬于同源性細胞族群，其甲基化修飾是抑癌基因失活的一種表現[11-12]。該研究結果顯示，未在正常結腸組織中發現BCL6B基因甲基化，而結腸癌細胞系內BCL6B基因甲基化率為67.86%，經去甲基化藥物處理后BCL6B表達上升，表明結腸癌細胞內BCL6B啟動子區域存在異常高甲基化狀況。堵一喬等[12]認為BCL6B基因甲基化可作為輔助診斷CRC的較好指標，且明顯可知健康人甲基化敏感度低至10%，而CRC患者甲基化率高達70%～100%，由此可明確，細胞BCL6B基因甲基化異常升高與是否罹患結腸癌，以及結腸癌嚴重程度息息相關。

綜上所述，結腸癌的發生及發展與BCL6B基因啟動子區域甲基化密切相關，BCL6B基因在結腸癌呈高甲基化，臨床TNM分期過高、高分化及有淋巴轉移均可影響甲基化，可為臨床診治結腸癌提供參考。但是該研究樣本量較少，還需多角度多方面取樣，進一步進行研討。