N-乙酰氨基葡萄糖對水稻的抗寒作用研究

劉洋 張洋 范立強 趙夢瑤 趙黎明

摘要：【目的】探究 N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，NAG）對水稻幼苗的抗寒效果及其潛在的抗寒機制，以期為NAG在農業免疫誘抗領域的應用提供理論依據。【方法】以水稻品種內5優907為供試材料，外源施用不同濃度（0、50、100、150 mg/L）的NAG進行根系培養，測定低溫條件下水稻幼苗的生長指標、葉綠素含量及可溶性糖含量，表征NAG的抗寒效果并篩選最適施用濃度。進一步在生理生化水平從滲透調節系統、根系系統、抗氧化系統和脫落酸代謝途徑探究NAG對水稻幼苗的抗寒機制。【結果】外源施用NAG可促進水稻幼苗在低溫環境下正常生長，具有明顯的抗寒效果，其最適施用濃度為100 mg/L，在此濃度下幼苗單株鮮重（0.118±0.009 g）、株高（21.21±0.72 cm）、根長（5.76±0.43 cm）及可溶性糖（41.031±0.992 μg/g）和總葉綠素含量（5.959±0.020 mg/g）較對照組漲幅最大，分別顯著增長14.14%、7.14%、7.22%、63.09%和36.79%（P<0.05，下同）。生理生化水平相關結果表明，100 mg/L NAG促進寒害幼苗中滲透調節物質積累，可溶性蛋白、脯氨酸和游離氨基酸積累量較低溫對照組分別顯著增長19.58%、19.49%和36.82%;保護幼苗根系系統，促進寒害幼苗根系活力提高至低溫對照組的1.56倍，并使莖葉組織中硝態氮含量下降15.65%;有效促進幼苗中丙二醛積累量下降23.92%，并將超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活力分別提高34.94%和25.42%，保護幼苗抗氧化系統;增加寒害幼苗脫落酸代謝通路中OsNCED、OsSDR和AAO基因表達量至低溫對照組的3.52、1.73和1.64倍，從而實現幼苗中內源脫落酸的積累。【結論】外源施用NAG根系處理能夠調控低溫脅迫下水稻幼苗滲透調節系統、根系系統、抗氧化系統及內源脫落酸代謝途徑，進而提高水稻抗寒性。

關鍵詞： N-乙酰氨基葡萄糖;水稻;抗寒性;脫落酸途徑

Abstract：【Objective】To evaluate the cold resistance effect of N-acetyl-D-glucosamineon on rice seedlings，and to further explore its potential cold resistance mechanism，with a view to providing the theoretical basis for the application of NAG in the field of agricultural immune induction. 【Method】With the rice variety Nei 5 You 907 as the test material，different concentrations（0，50，100，150 mg/L） NAG were exogenously applied to rice seedlings for root culture. The growth potential，growth index，chlorophyll content and soluble sugar content of rice seedlings under low temperature conditions were measured to characterize the cold resistance effect of NAG and to screen the optimum applied concentration. Furthermore，the cold resistance mechanism of NAG on rice seedlings was explored from osmotic adjustment system，root system，antioxidant system and abscisic acid metabolism pathways at the physiological and biochemical level. 【Result】Exogenous application of NAG promoted the growth of rice seedlings in low temperature environments，and had obvious cold resistance effect. The optimum applied concentration was 100 mg/L. Under this concentration，the fresh weight（0.118±0.009 g），plant height（21.21±0.72 cm），root length（5.76±0.43 cm），soluble sugar（41.031±0.992 μg/g） and the total chlorophyll content（5.959±0.020 mg/g）of seedlings increased the most in comparison with the control group，which significantly increased by 14.14%，7.14%，7.22%，63.09% and 36.79% respectively（P<0.05，the same below）. The results of the physiological and biochemical level showed that 100 mg/L NAG promoted the accumulation of osmotic adjustment substances， soluble protein， proline，free amino acid in the cold injury seedlings increased significantly by 19.58%，19.49% and 36.82% respectively compared with the control group;effectively protected the root system of seedlings，the root acti-vity of cold injury seedlings was increased to 1.56 times，and the nitrate nitrogen content in the stem and leaf tissues was decreased by 15.65% compared with the low-temperature control group;effectively reduced the accumulation of malondialdehyde in the cold injury seedlings by 23.92% and increased the activities of superoxide dismutase（SOD） and peroxidase（POD） by 34.94% and 25.42% respectively，thereby protecting the antioxidant system of seedlings;increased the OsNCED，OsSDR and AAO genes expression in the abscisic acid metabolism pathway to 3.52，1.73 and 1.64 times of low temperature control，so as to achieve the accumulation of endogenous abscisic acid in cold injury seedlings. 【Conclusion】Exogenous application of NAG with root treatment can regulate osmotic adjustment system，root system， antioxidant system and the endogenous abscisic acid metabolism pathway of rice seedlings under cold stress，thereby improving the cold resistance of rice.

Key words： N-acetyl-D-glucosamine; rice; cold resistance; abscisic acid pathway

0 引言

【研究意義】植物生長過程中通常會面臨生物脅迫（病毒、蟲害、真菌等）及非生物脅迫（寒害、旱害、鹽堿、礦物質缺乏、重金屬等）的壓力，其中溫度是植物生長發育的重要條件之一（Lukatkin et al.，2012）。水稻作為亞熱帶喜溫植物，對低溫環境敏感，低溫會造成水稻幼苗生長發育不良甚至死亡，嚴重影響水稻產量（Hussain et al.，2016）。為提高植物的抗寒能力，脫落酸、多效唑、氯膽堿等植物生長調節劑及甜菜堿、多胺等化合物作為抗寒劑已被廣泛應用（Hussain et al.，2018）。化學抗寒劑雖效果較優，但易產生化學殘留并危害植物生長，造成環境污染。所以開發對植物威脅小、綠色、安全且具有良好經濟效益的植物免疫誘抗劑尤為重要。目前，甲殼素及其衍生物作為含氮多糖，憑借其安全、綠色等優勢已被廣泛應用于免疫誘抗領域，N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，NAG）是葡萄糖分子中C2上羥基被乙酰氨基所替代的一種氨基己糖，是構成甲殼素的結構單元物質，但其在植物免疫誘抗領域的應用研究較為少見。此外，關于外源功能性糖在植物抗寒領域的機制研究尚不清晰，對于相關代謝通路的研究尚不深入。因此，探究NAG對水稻幼苗的抗寒作用及其潛在的抗寒機制，可為NAG在農業免疫誘抗領域的應用提供理論支撐，對保護水稻抵御外界低溫脅迫損傷具有重要意義。【前人研究進展】郝林華等（2006）研究指出，牛蒡寡糖作為新型寡糖可顯著保護低溫脅迫后黃瓜幼苗細胞膜穩定性及抗氧化酶系統，進而調控植物抗寒。劉瑞志等（2009）研究發現，0.2%的褐藻寡糖通過提高煙草的抗逆酶活力，減少寒害對細胞組織的損傷，促進其抵御寒害逆境。劉同梅（2018）研究表明，海藻酸鈉寡糖通過誘導水楊酸通路激活擬南芥免疫途徑達到抗病效果。此外，殼寡糖和幾丁寡糖作為兩種不同的甲殼素類氨基寡糖，已有較成熟的產品被開發應用于植物免疫誘抗領域（Yin et al.，2016）。Shigeru等（2006）研究發現，幾丁寡糖通過誘導水稻根及葉中激發子響應基因及抗性防御基因表達，在水稻中傳遞系統性信號并抵御稻瘟病真菌。姚艷平等（2013）研究表明，幾丁寡糖可通過誘導調控抗病相關酶活性及相關植物保衛素等機制調控機體，抑制木霉菌的產生。王夢雨等（2016）研究報道，噴施殼寡糖可促進小麥中可溶性糖、脯氨酸等低溫抗性相關物質表達，保護小麥抵抗低溫脅迫。田路（2019）研究了殼寡糖對不同花椒種質間耐寒性差異的影響，發現100 mg/L殼寡糖處理能有效調節寒害花椒幼苗的滲透系統及抗氧化系統，從而促進其抗寒。【本研究切入點】相關研究表明，乙酰基團在植物免疫誘抗中發揮重要作用，而NAG作為一種含有乙酰基團的甲殼素結構單元，具有抗菌（Gaderer et al.，2017）、抗病（Kashulin et al.，2000）等多方面生理活性，推測其在水稻抗寒領域可能具有較大的應用潛力，但其在農作物免疫誘抗領域鮮有研究。同時，NAG現已實現發酵法進行大規模的生物制造，將其應用于農業領域能降低現有抗寒成本，具有良好的經濟效益和市場前景。【擬解決的關鍵問題】以水稻品種內5優907為供試材料，外源施用不同濃度NAG進行根系培養，測定并比較低溫條件下水稻幼苗的長勢及生長指標，并進一步在生理生化水平上分析NAG對水稻幼苗脫落酸代謝通路、滲透調節系統、根系系統和抗氧化系統的調控影響，探究NAG根系處理對水稻的抗寒效果及其潛在的抗寒機制，為NAG在農業免疫誘抗領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為內5優907水稻種子，購自四川豐禾種業有限公司;N-乙酰氨基葡萄糖（分子式為C8H15NO6，分子量為221.09，純度為98%）購自山東潤德生物科技有限公司;脯氨酸、茚三酮、磺基水楊酸、硫代巴比妥酸和氮藍四唑等均為分析純，購自泰坦科技股份有限公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 植物培養與處理 選擇粒大飽滿、顆粒均勻的水稻種子置于清水中充分浸泡，將沉于底部的質量較好的種子進行清水漂洗并浸泡于75%乙醇溶液消毒15 min，清水沖洗數遍直至無乙醇殘留。將水稻種子置于30 ℃去離子水中浸種48 h，然后于30 ℃暗處催芽24 h。待其露白后，小心挑選露白一致的水稻種子移至96孔板中培養，然后將其移至植物光照培養箱中進行水培。培養條件：溫度25 ℃，相對濕度75%，光照周期16 h/8 h（晝/夜）。為促進水稻種子及時獲得營養，結合幼苗培養過程中的實際生長狀態，水培（去離子水）約7 d后換用營養液培養（營養液參照國際水稻研究所研制的營養液配方配置），每隔2 d換液一次。

待幼苗生長至2葉1心期（共14 d左右）時添加NAG進行根系培養，具體方法如下：（1）抗寒效果濃度篩選時，NAG處理水平分別為0（對照）、50、100和150 mg/L。在光周期中光照條件下開始進行幼苗加糖的根系培養，加糖處理48 h后，開始低溫脅迫處理（溫度為5 ℃）24 h。（2）抗寒機制研究時，基于篩選得到的最優NAG處理濃度，幼苗分為常溫對照組（未加NAG根系處理幼苗，常溫培養）、常溫處理組（施用NAG最優濃度根系處理幼苗，常溫培養）、低溫對照組（未加NAG根系處理幼苗，5 ℃低溫脅迫培養24 h）和低溫處理組（施用最優NAG濃度根系處理幼苗，5 ℃低溫脅迫培養24 h）。隨后在光照處理條件下進行取樣，液氮冷凍后儲存于-80 ℃冰箱，測定后續相關指標。

1. 2. 2 幼苗生長指標測定 隨機選取40～50株新鮮水稻幼苗，將幼苗根部用濾紙輕輕擦拭以吸去根部表面水分，測定單株幼苗鮮重。分別測定幼苗根基部到最上部展開葉葉鞘頂部的距離和到根尖部位的距離，即為幼苗株高和根長。

1. 2. 3 幼苗相關生理生化指標測定 生理生化指標測定參照王學奎和黃見良（2015）的方法。幼苗葉綠素含量采用乙醇提取比色法測定;可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍染色法測定;脯氨酸含量采用磺基水楊酸比色法測定;游離氨基酸含量采用茚三酮顯色法測定;根系活力采用氯化三苯基四氮唑TTC法測定;莖葉組織硝態氮含量采用水楊酸法測定;幼苗丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸反應法測定;超氧化物歧化酶（SOD）活力采用氮藍四唑法測定，過氧化物酶（POD）活力采用愈創木酚顯色法測定;脫落酸含量參照酶聯免疫分析試劑盒（紀寧生物科技有限公司）的說明方法測定。

1. 2. 4 實時熒光定量PCR測定脫落酸通路關鍵基因表達 水稻葉片總RNA提取、反轉錄及實時熒光定量PCR測定分別按照相應試劑盒說明書（諾唯贊生物科技有限公司）進行。于NCBI搜索水稻脫落酸代謝通路相關基因及常用水稻內參基因β-Actin序列，所用引物序列詳見表1。

1. 3 統計分析

采用Excel 2010及SPSS 21進行數據處理，采用GraphPad Prism 8.0作圖，采用LSD法進行數據顯著差異性分析。

2 結果與分析

2. 1 NAG對水稻幼苗抗寒性的影響

2. 1. 1 不同濃度NAG對低溫脅迫下水稻幼苗生長的影響 經不同濃度NAG根系培養后，由寒害幼苗整體生長情況（圖1-A）可看出，低溫寒害后，0 mg/L對照組幼苗整體萎蔫不立挺，葉片形態發生變化，葉緣失水、葉尖卷曲;而經50和100 mg/L NAG根系培養的幼苗表型更立挺，葉片顏色更鮮綠，幼苗整體生長狀態較對照組更優。表明外源施用NAG能夠緩解低溫對水稻的傷害，保護水稻幼苗。

由圖1-B和圖1-C可知，與0 mg/L對照組相比，經50、100和150 mg/L NAG處理后幼苗的單株鮮重分別增加11.94%、14.14%和9.93%;株高分別增加3.81%、7.14%和6.38%，且均與對照組差異顯著（P<0.05，下同）。從圖1-D可看出，50 mg/L NAG根系培養后幼苗根長與對照組無顯著差異（P>0.05，下同），而100和150 mg/L NAG根系培養后幼苗的根長較對照組分別顯著增加7.22%和5.87%。可見NAG根系處理對幼苗在低溫條件下的促生長效果顯著，能保護幼苗正常生長，其中，100 mg/L NAG處理組幼苗恢復生長的效果最佳，其單株鮮重（0.118±0.009 g）、株高（21.21±0.72 cm）和根長（5.76±0.43 cm）均為最大值。

2. 1. 2 不同濃度NAG對低溫脅迫下水稻幼苗葉綠素及可溶性糖含量的影響 圖2-A和圖2-B分別顯示了不同濃度NAG根系培養的幼苗在低溫脅迫24 h及低溫脅迫后于正常溫度下恢復生長時葉綠素含量的變化。由圖2-A可知，與0 mg/L對照組相比，經50、100和150 mg/L NAG處理后寒害幼苗的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量均呈增加趨勢，且同一指標不同處理組間差異顯著，其中，100 mg/L NAG處理對寒害幼苗光合系統的促進作用相對較好，其葉綠素a含量（4.253±0.016 mg/g）、葉綠素b含量（1.707±0.008 mg/g）及總葉綠素含量（5.959±0.020 mg/g）較對照組增幅最大，分別顯著增加36.65%、37.13%和36.79%。說明NAG根系處理能促進寒害幼苗葉綠素的合成，保護幼苗進行正常的光合作用以抵御寒害損傷。由圖2-B可知，100 mg/L NAG處理還能顯著促進寒害幼苗在恢復生長過程中的葉綠素積累，保證后續正常生長，相比對照組其幼苗中葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量分別顯著提高14.76%、20.17%和18.94%。

從圖2-C可知，50、100和150 mg/L NAG根系處理促進了幼苗在低溫下滲透調節物質可溶性糖的積累，分別較對照組增加23.26%、63.09%和40.46%，其中，100 mg/L NAG處理組的可溶性糖含量（41.031±0.992 μg/g）增長趨勢最明顯，且各處理組間差異均達顯著水平。說明NAG可有效調控寒害幼苗機體滲透勢，從而保護幼苗抵御寒害損傷。

綜合對比幼苗的長勢、生長指標、葉綠素含量及可溶性糖積累等結果，發現低溫脅迫過程中，外源施用一定濃度的NAG可保護水稻幼苗在低溫環境下正常生長，提高水稻的抗寒效果。從不同濃度NAG的抗寒效果及經濟效益考慮，本研究中100 mg/L為最適施用濃度。

2. 2 NAG對水稻幼苗的抗寒生理生化機制研究

2. 2. 1 NAG對水稻幼苗滲透調節系統的影響 由圖3-A可看出，100 mg/L NAG根系處理對常溫環境幼苗起到促生長作用，同時在一定程度上緩解了低溫對水稻生長的損傷，促進幼苗正常生長。

由圖3-B～圖3-D可看出，低溫對照組的可溶性蛋白含量較常溫對照組提高19.88%，低溫處理組的可溶性蛋白含量較常溫處理組提高13.83%;低溫對照組幼苗脯氨酸含量是常溫對照組幼苗的1.93倍，而低溫處理組幼苗的脯氨酸含量升高至常溫處理組的2.07倍，表明在遭受低溫脅迫后，水稻幼苗能在一定程度上通過積累可溶性蛋白和脯氨酸來調控自身代謝，而外源施用NAG進一步促進了寒害幼苗中可溶性蛋白、脯氨酸和游離氨基酸的積累量，較低溫對照組分別顯著增長19.58%、19.49%和36.82%，從而更進一步調控幼苗機體滲透勢，保護其抵抗寒害逆境影響。

2. 2. 2 NAG對水稻幼苗根系系統的影響 由圖4-A可看出，低溫脅迫會導致幼苗的根系活力下降，其中低溫對照組的根系活力較常溫對照組幼苗降低23.15%，低溫處理組的根系活力較常溫處理組降低36.17%;而外源NAG能在常溫及低溫環境下促進幼苗根系活力分別提高至相應對照的1.88和1.56倍，說明NAG能有效緩解低溫對幼苗根系的傷害，從而保護水稻根系抵御逆境脅迫。

由圖4-B可知，低溫脅迫24 h后低溫對照組水稻幼苗莖葉部位的硝態氮含量較常溫對照組提高23.62%，表明低溫會造成幼苗莖葉組織的硝態氮積累，抑制其被進一步轉化利用;而NAG處理顯著降低常溫及寒害幼苗中硝態氮含量，較相應對照組分別降低12.37%和15.65%，促進了幼苗莖葉組織對根系硝態氮的充分轉化，從而調控機體代謝并抵御寒害。

2. 2. 3 NAG對水稻幼苗抗氧化系統的影響 由圖5-A可知，低溫會導致水稻幼苗中MDA積累，其中低溫對照組水稻幼苗MDA含量較常溫對照組顯著增加36.65%，而低溫處理組幼苗較常溫處理組僅增加11.63%，可見NAG根系處理能減緩低溫環境幼苗的MDA積累。同時外源NAG能有效降低寒害幼苗中MDA含量，較低溫對照組顯著下降23.92%。

由圖5-B和圖5-C可知，寒害處理后低溫對照組較常溫對照組幼苗的SOD活力顯著提高19.68%，POD活力顯著提高20.21%。NAG的施用能進一步提高幼苗的SOD和POD活力，其中常溫處理組較常溫對照組幼苗SOD活力顯著提高36.34%，POD活力略有提高但差異不顯著;而低溫處理組較低溫對照組幼苗的SOD和POD活力分別顯著提高34.94%和25.42%，表明NAG有效保護了幼苗的抗氧化系統，減緩過氧化損傷以抵抗寒害逆境。

2. 2. 4 NAG對水稻幼苗脫落酸代謝調節的影響

由圖6-A可看出，低溫脅迫后，幼苗自身脫落酸積累量增加，低溫對照組幼苗的脫落酸含量較常溫對照組增加16.18%;外源施用NAG后低溫處理組較低溫對照組幼苗的脫落酸含量顯著提高16.45%，說明NAG根系處理能進一步促進寒害幼苗的脫落酸積累。

OsZEP、OsNCED、OsSDR和AAO基因是植物脫落酸代謝通路中4類關鍵酶——玉米黃質環氧化酶（Zeaxanthin epoxidase，ZEP）、9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）、短鏈醇脫氫/還原酶（Short chain dehydrogenases/reductases，SDR）和脫落醛氧化酶（Abscisic aldehyde oxidase，AO）分別對應的4個關鍵調控基因（Wan and Li，2004）。由圖6-B～圖6-E可知，正常條件下，NAG常溫處理組幼苗中OsNCED和AAO基因相對表達量分別增長至常溫對照組的2.32和1.50倍，OsZEP基因相對表達量顯著下降，而OsSDR基因相對表達量無顯著變化。低溫脅迫后，無論是無糖處理組還是NAG處理組水稻幼苗中4種基因的相對表達量均呈下降趨勢;但外源施用NAG能顯著促進寒害幼苗中OsNCED、AAO和OsSDR基因的相對表達。其中，低溫處理組幼苗的OsNCED和AAO基因相對表達量分別顯著提升至低溫對照組的3.52和1.64倍，OsSDR基因相對表達量增長至1.73倍，幾乎已恢復至幼苗未經寒害處理時的水平。表明NAG根系處理能在低溫脅迫條件下調控水稻幼苗脫落酸代謝途徑中OsNCED、OsSDR和AAO等脫落酸生物合成關鍵基因的表達，從而進一步顯著促進寒害水稻幼苗中內源脫落酸的合成與積累來抵御寒害損傷。

3 討論

植物的生長狀態能直觀地反映植物面對外界寒害等逆境的感應及耐受能力。研究表明低溫會延緩水稻等農作物的生長發育，造成葉片壞死、脫色、白化、衰老發黃萎蔫、葉面積減小等嚴重損傷（Li et al.，2017）。本研究發現，外源施用NAG根系培養能有效緩解寒害下水稻幼苗萎蔫、葉緣失水、葉尖卷曲等不良狀態，使幼苗的生長狀態更優，表明NAG能有效減緩低溫對水稻的損傷，具有促進水稻抗寒的效果。植物單株鮮重、株高、根長等生長指標能反映植物地上部分及根系組織的生長情況，鄭典元等（2012）研究指出殼寡糖能促進水稻株高、根長等生長指標，降低電導率，提高過氧化氫酶（CAT）活性，進而提高水稻抗寒性。張運紅等（2017）研究表明，鎘脅迫下外源噴施海藻酸鈉寡糖可提高水稻幼苗的株高、穗長和千粒重，進而促進水稻正常生長發育。本研究結果與上述研究結果相似，施用NAG根系處理后水稻幼苗的單株鮮重、株高和根長均較對照組明顯提高，表明NAG對低溫條件下水稻根系及地上莖葉組織的促生長效果顯著，能保護幼苗在低溫脅迫下正常生長發育，推測其在植物抗寒領域具有較好的實際應用潛力。

光合作用的強弱可反映植物的生長狀態，而葉綠素是評價植物光合能力的重要指標，其含量高低與植物抗寒性密切相關，冷適應能力強的植物能通過調控葉綠素等光合作用色素的合成代謝來抵御寒害影響（Liu et al.，2018）。本研究結果表明，NAG可促進水稻在低溫脅迫及恢復生長過程中葉綠素含量的積累，促使寒害幼苗保持正常的光合作用。與姜秀梅（2014）研究報道的殼聚糖、甜菜堿、水楊酸等外源物質可提高寒害辣椒幼苗中葉綠素含量和滲透調節物質積累，進而提高其抗冷性的結論基本一致。但本研究結果與張洋（2018）研究中指出的殼寡糖可促進水稻寒害后恢復過程的葉綠素合成，而對水稻低溫脅迫過程中葉綠素積累無顯著促進作用的研究結果存在差異，表明不同外源糖對植物葉綠素的合成調控會有所不同，其原因可能在于NAG作為含氮多糖可充當氮源參與水稻碳氮代謝過程從而調控寒害過程中的光合能力，但具體原因尚需進一步研究。

滲透調節是植物抵抗逆境脅迫的重要調控機制，植物體通過積累可溶性糖（蔗糖、海藻糖等）、脯氨酸、可溶性蛋白、有機酸、鉀和鈣離子等不同類型的滲透調節離子或分子，以滲透調節、活性氧解毒、細胞膜穩定等方式維系植物體內水分環境并調控機體滲透勢，從而抵抗逆境壓力（Singh et al.，2015;邢芳芳等，2018）。本研究中，適宜濃度的NAG可有效促進寒害幼苗中可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和游離氨基酸等滲透調節物質顯著積累，與匡銀近等（2009）通過殼寡糖浸種處理可增加水稻幼苗中可溶性糖、脯氨酸等滲透調節物質并減少電解質滲透，從而提高水稻抗冷性的研究結果相似，說明外源NAG可有效調節寒害水稻的滲透調節系統進而抵御寒害逆境。

根系是植物體重要的營養物質與水分吸收器官，根系活力是反映幼苗根系生長狀況的重要指標，根系活力越高，植物對外界營養吸收的能力越強，相對抗寒能力越強（陳明輝等，2018）。本研究中，低溫條件下水稻的根系活力大大下降，而外源施用NAG能促進寒害水稻幼苗根系活力提高，說明NAG能有效緩解低溫逆境對根系系統的損傷，保護幼苗根系系統。此外，硝酸鹽是植物生長的主要氮源，可促進植物調節自身碳氮代謝、營養吸收及生長發育等過程（張鵬等，2015）。本研究中，外源NAG使得寒害水稻的地上莖葉組織中硝態氮積累量顯著下降，說明NAG能有效促進水稻莖葉組織對根系硝態氮的運輸、吸收與還原同化，將硝態氮充分利用并轉化進而提高水稻抗寒性。

抗氧化能力是表征植物抗性的重要指標之一，機體中脂質過氧化有害產物（MDA等）含量越少、抗氧化酶活性越高，機體抗氧化防御能力越強，抗寒能力越強（Ao et al.，2013）。Zou等（2017）研究指出外源施用不同聚合度的殼寡糖能促進小麥生長、降低MDA濃度、有效調控SOD、POD、CAT等抗氧化基因的表達并提高對應的抗氧化酶活性，從而緩解外界冷脅迫的損傷。Cao等（2014）研究表明外源蔗糖通過提高黃瓜葉片中SOD等抗氧化酶活性來提高黃瓜幼苗抗寒性。本研究與上述研究結果相似，當外源施用NAG進行根系處理時，寒害水稻幼苗中MDA積累量顯著降低，SOD和POD活力均明顯增加，表明NAG對寒害水稻幼苗的抗氧化系統具有保護作用。

目前，關于外源功能性糖在植物抗寒領域的研究主要與抗寒相關表型和生理生化調控指標相關，對于相關代謝通路的研究尚不深入。在已有研究報道中，陳巧（2016）從光合作用通路角度對殼寡糖誘導水稻的抗寒機制進行研究，證明殼寡糖修復了光損傷的光合系統II，加速了葉綠素b合成，通過改變滲透調節并減少氧化損傷從而提高水稻冷脅迫耐受性。Zhang等（2019）研究發現根系施用殼寡糖能誘導寒害水稻谷氨酸及脯氨酸通路相關關鍵基因表達，通過促進水稻谷氨酸代謝進而調控脯氨酸代謝，最終保護水稻幼苗抵御寒害。在眾多代謝調控中，植物激素是植物面對逆境環境時調節自身生理和分子反應時最主要的內源物質之一，激素代謝調控在植物抵抗逆境脅迫時發揮關鍵作用（Fahad et al.，2015）。其中脫落酸作為植物面臨寒害等逆境環境時的重要“脅迫激素”，可通過促進寒害幼苗根部疏水，清除有害自由基，調控機體迅速啟動抗寒相關基因等過程來抵御寒害損傷（Cutler et al.，2010）。楊章旗（2011）研究表明，內源脫落酸在植物抗寒機制中發揮重要作用，低溫脅迫條件下馬尾松能通過調控自身內源脫落酸含量變化來調控自身SOD、POD、CAT、多酚氧化酶（PPO）等抗氧化酶活性的變化趨勢，進而提高自身耐寒能力。劉航等（2015）研究指出，褐藻膠寡糖通過上調小麥中TaNCED、TaAOX和TaBG等脫落酸合成基因的轉錄，調控小麥脫落酸合成信號通路，進而刺激小麥葉片中內源脫落酸積累，并參與褐藻膠寡糖誘導的植物抗旱過程。Sharma等（2019）研究發現，水分脅迫下施用褐藻提取物能通過調控脫落酸生物合成基因表達進而調節脫落酸穩態，并特異性增強干旱脅迫保護基因表達，提高小麥耐旱性。本研究從脫落酸代謝通路入手，對NAG誘導水稻的抗寒機制進行研究，結果表明低溫會造成水稻幼苗脫落酸代謝途徑中關鍵基因OsZEP、OsNCED、AAO和OsSDR的表達量下降，但外源施用NAG能顯著促進寒害幼苗中OsNCED、AAO和OsSDR基因的相對表達，從而實現幼苗中內源脫落酸積累量增長，推測外源NAG能通過調控水稻幼苗的脫落酸激素代謝途徑來抵御寒害損傷。本研究從相關脅迫激素的代謝角度出發對NAG誘導水稻的抗寒機制進行闡述，在現有研究基礎上，未來可與相關轉錄組學、代謝組學等方法結合，更全面地探究相關抗逆調控機制。因此，基于以上研究結果，推測NAG能充當糖原物質和信號物質，通過兩種效應發揮協同作用，共同調控水稻幼苗抵抗外界低溫脅迫損傷。

4 結論

低溫脅迫下，采用根系處理方式外源施用NAG可保護水稻幼苗，恢復幼苗低溫脅迫后生長過程中葉綠素的積累，促進其在低溫環境下正常生長。其可能的調控機制在于：首先，NAG調節水稻幼苗的機體滲透勢，促進滲透調節物質的積累和硝態氮的轉化利用;其次，NAG的外源施用有效降低寒害幼苗中MDA含量，提高SOD和POD抗氧化酶活力，保護幼苗抗氧化系統;此外，NAG顯著促進寒害幼苗脫落酸代謝通路中OsNCED、OsSDR和AAO基因表達，進而促進幼苗中內源脫落酸積累，通過脫落酸代謝途徑保護幼苗抵御寒害。

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（責任編輯 王 暉）