基于生物信息學方法分析MUC1基因在卵巢癌中的表達及意義

林少沖，徐麗達，杜俊鵬，王凱，王寶金

(1.鄭州大學第三附屬醫院 婦科，河南 鄭州 450052；2.河南省卵巢惡性腫瘤國際聯合實驗室，河南 鄭州 450052；3.同濟大學附屬第一婦嬰保健院 轉化醫學研究中心，上海 201204)

卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、易轉移、復發率高和高度耐藥等惡性生物學行為[1-2]。手術切除及術后輔助化療使部分卵巢癌患者從中獲益，但是卵巢癌患者的5 a總體生存率仍不理想[3]。近年來，靶向治療及免疫治療在多種腫瘤治療中展現出巨大的優勢，如PD-1抑制劑可以阻斷免疫檢查點PD-1，激活免疫系統產生腫瘤免疫應答，已用于癌癥治療中[4]。MUC1在臨床研究和腫瘤基礎研究領域一直備受關注。本研究旨在分析MUC1在卵巢癌中的表達水平及意義，為以MUC1為靶點的卵巢癌免疫治療策略提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 GEPIA數據庫篩選條件如下。(1)“gene: MUC1”。(2)“Expression DIY: Boxplot”。(3)“Datasets selection: OV”。檢索MUC1轉錄組水平變化。

1.2 HPA數據庫利用人類蛋白圖譜數據庫(the human protein atlas，HPA)比較卵巢癌組織和正常卵巢組織中MUC1蛋白表達情況。

1.3 LinkedOmics數據庫檢索步驟如下。(1)cancer type database：卵巢癌TCGA數據集。(2)data type：mRNA expression(RNA seq)。(3)選擇基因MUC1并應用pearson correlation test分析，得到與ESPL1正負相關的基因。(4)進行GSEA分析(GO生物功能和KEGG通路富集分析)。將得到的正負相關基因進行Cmap分析尋找潛在小分子藥物。

1.4 Kaplan-Meier 生存分析利用Kaplan-Meier Plotter 數據庫進行生存分析。篩選條件如下。(1)“Cancer：Ovarian Cancer”。(2)“Gene：MUC1”。(3)“Survival：OS和FPS”。

1.5 統計學方法采用SPSS 22.0統計軟件處理數據。卵巢癌組織與正常組織表達差異的比較，采用t檢驗。MUC1表達與卵巢癌預后的關系采用Kaplan-Meier生存分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1MUC1基因在腫瘤中的表達概況首先，利用GEPIA數據庫探究MUC1基因在33種常見腫瘤中的表達情況。如圖1所示，MUC1在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸潤癌(BRCA)、宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC)、膠質母細胞瘤(GBM)、低級別膠質瘤(LGG)、胰腺癌(PAAD)、胸腺癌(THYM)和子宮內膜癌(UCEC)中表達明顯升高；腎上腺皮質腫瘤(ACC)、腎透明細胞癌(KIRC)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、肺鱗癌(LUSC)、皮膚黑色素瘤(SKCM)和睪丸癌(TGCT)中MUC1基因表達水平明顯降低。

圖1 MUC1基因在33種常見腫瘤中的表達情況

2.2 MUC1在卵巢癌中的表達GEPIA數據庫中比較了426個卵巢癌組織和88個正常卵巢組織的MUC1mRNA水平。腫瘤組織中MUC1表達明顯高于正常組織，見圖2A。同時，MUC1的異常高表達在GSE18520數據集得到了再次驗證，見圖2B。通過HPA數據庫中的免疫組化數據，探索MUC1蛋白的表達情況。圖2C和圖2D使用相同的抗體染色，但是染色的強度和質量明顯不同。癌組織中檢測到較高的表達強度，但在正常卵巢組織中未檢測到MUC1蛋白的表達。

2.3 MUC1與卵巢癌患者預后的關系Kaplan-Meier生存曲線顯示，MUC1高表達患者的無瘤進展生存時間(18.6個月)明顯短于MUC1低表達的卵巢癌患者的無瘤進展生存時間(22個月)(P<0.05)。但是MUC1高表達組與低表達組患者的總體生存時間比較，差異無統計學意義(P=0.15)，見圖3B。

臨床分期Ⅰ期和Ⅱ期卵巢癌患者的亞組中，MUC1的表達與預后無關，見圖3C。但是臨床分期Ⅲ期和Ⅳ期的卵巢癌患者的亞組中， MUC1低表達組患者總生存時間明顯長于高表達組(P<0.05)，見圖3D。與此類似的是，亞組分析顯示，TP53基因突變是影響患者預后的危險因素(HR=1.35)。突變組中MUC1基因高表達患者預后較差，但在TP53基因野生型亞組中，MUC1表達與預后無關。見圖3E、3F。

A.GEPIA數據庫中MUC1 mRNA水平；B.GSE18520數據集中MUC1 mRNA表達水平；C、D.HPA數據庫中卵巢癌和正常卵巢組織MUC1蛋白免疫組織化學結果

A.無瘤進展生存時間；B.總體生存時間；C.Ⅰ期和Ⅱ期亞組；D.Ⅲ期和Ⅳ期亞組；E.TP53突變型；F.TP53野生型。

2.4 MUC1在卵巢癌中的生物學功能分析LinkedOmics數據庫探索了MUC1引起卵巢癌患者預后較差的潛在分子機制。GO富集分析顯示MUC1與細胞免疫密切相關，參與了適應性免疫反應、體液免疫反應等免疫相關生物學過程。同時，KEGG通路富集分析發現MUC1與Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路和TNF信號通路等癌癥相關信號通路相關，見表1。LinkedOmics數據庫中miR-503、miR-499、miR-154和miR-29a等在卵巢癌中可能靶向MUC1，起負向調控作用，見表2。

表1 卵巢癌中MUC1及其密切相關基因的GO富集分析和KEGG通路富集分析

2.5MUC1的潛在治療價值Pearson相關分析結果顯示，MUC1與ELF3、HTR3A、LCN2、CFB及APOL1等表達呈正相關，與MEST、SALL2、TET1、SMO和C10orf82等表達呈負相關，見表3。基于MUC1正負相關基因，CMap分析結果顯示，褪黑素、納多洛爾和甲芐肼為對卵巢癌具有潛在治療價值的3種小分子藥物，并在PubChem數據庫中獲取了上述3種藥物的二維和三維結構，見圖4。

表2 對MUC1表達具有負性調控作用的miRNA

表3 MUC1最正和最負相關的5個基因

A.褪黑素；B.納多洛爾；C.甲芐肼

3 討論

MUC1黏蛋白是一種屬于黏蛋白家族的Ⅰ型高度糖化跨膜蛋白，對黏膜起潤滑、保護作用，并且在上皮更新與分化及維持上皮完整性等方面起重要作用[5]。MUC1基因是一種癌基因，研究發現，其在乳腺癌、肺癌、結直腸癌、甲狀腺癌和肝癌中呈現出過表達的狀態，并且表達水平與腫瘤惡性程度相關[6-7]。本文從基因表達、臨床預后、調控機制等多角度、多層面探究了MUC1在卵巢癌中的表達和臨床意義，為尋找可靠腫瘤標志物和了解卵巢癌惡性過程提供新思路。

MUC1基因表達紊亂，在多種腫瘤類型中普遍存在。Jing等[8]證實MUC1在乳腺癌中異常高表達，且可作為乳腺癌潛在預后和治療靶點。還有學者指出，MUC1蛋白著色強度在增生活躍的癌細胞中更明顯，提示MUC1的表達量隨病情加重而增加。對大樣本數據進行Kaplan-Meier生存分析發現，MUC1高表達患者的無瘤進展時間明顯短于低表達患者。進一步的亞組分析發現，高臨床分期及TP53突變患者的預后與MUC1的表達密切相關。TP53基因編碼p53蛋白，監測細胞的分裂，能影響細胞進行DNA修復，修復失敗后激活下游基因使細胞凋亡，發揮抑制腫瘤作用[9]。臨床分期高及TP53基因突變都是卵巢癌患者預后的高危因素，推測MUC1可能加速卵巢癌的惡性進展使患者的生存時間縮短。

近年來，MUC1在腫瘤免疫領域受到越來越多的關注。有研究表明，MUC1可以通過和腫瘤微環境中的免疫細胞相互作用促進腫瘤細胞的免疫逃逸[10]，MUC1參與到適應性免疫、T細胞介導的免疫反應和抗原的處理和呈遞等多種免疫過程。通路富集分析顯示，MUC1與NF-κB、TNF等細胞信號通路密切相關。有研究發現，MUC1可以幫助腫瘤細胞抵抗TNF相關凋亡誘導配體引起的細胞損傷，參與腫瘤細胞的免疫逃逸，加速癌癥的惡性進程。另外，MUC1可以與NF-κB、p65和轉錄因子TWIST等形成復合物，誘導活化EMT相關蛋白的表達，促進EMT進程[11]。MUC1胞外區域的抗MUC1單克隆抗體正在成為包括乳腺癌在內的多種癌癥的治療手段[12]。鑒于MUC1在腫瘤免疫和癌癥相關通路中的關鍵作用，MUC1有望成為卵巢癌免疫治療的新靶點。

本研究結果顯示，miR-512-5p等miRNA與MUC1存在負性調控關系，與相關研究結果一致[13]。褪黑素和甲芐肼等小分子藥物可以抑制MUC1的表達，對卵巢癌具有潛在的治療價值。褪黑素是松果體分泌的內源性藥物，具有抗癌作用，如調控細胞周期、促進細胞凋亡、抗血管生成、抗炎和抗氧化，還能調節各種免疫系統內細胞和細胞因子[14]。甲芐肼是一種細胞周期非特異性抗腫瘤藥物，現主要應用于霍奇金淋巴瘤和黑色素瘤等多種癌癥的治療中[15]，其抗卵巢癌作用有待于進一步揭示。這些miRNA及小分子藥物的應用將為卵巢癌治療提供新思路。

綜上所述，本研究通過多數據的聯合應用，多層次、多角度地分析了MUC1在卵巢癌惡性進程中的作用，MUC1基因在卵巢癌中異常高表達并與患者預后不良相關，有希望成為卵巢癌靶向治療的新靶點。