基于生物信息學的胃癌關鍵基因的鑒定和預后分析

侯慧軒，王俊杰，郭偉華

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院/新鄉(xiāng)醫(yī)學院第四臨床學院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

胃癌(gastric cancer，GC)是最常見的消化道腫瘤之一，發(fā)病率、病死率高[1]。GC的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果，如飲食、生活方式、遺傳因素和幽門螺桿菌感染等[2]。目前，GC治療的方式越來越多樣化，主要包括手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療[3-4]，但多數(shù)GC患者診斷時已是晚期，生存率低[5]。因此，積極尋找GC的診斷、預后生物標志物和潛在治療靶點十分重要。

近年來隨著生物信息學技術的發(fā)展，其在疾病診斷、預后和篩選治療藥物等方面起著重要的作用[6]。利用生物信息學技術可以明確GC細胞周期相關基因及其表達情況[7]，但關于GC的發(fā)病機制仍不清楚。細胞癌變過程中參與調(diào)控的基因眾多，并且不同基因之間存在復雜的相互作用，單個基因的研究有很大局限性。生物信息學可以從宏觀上分析大數(shù)據(jù)，在多基因水平研究腫瘤，從而能夠更好地探索疾病發(fā)病機制。本研究應用生物信息學分析方法，篩選GC相關差異表達基因，對差異表達基因進行基因功能富集分析，篩選GC相關的關鍵基因并進一步構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(protein-protein interaction network，PPI)，最后對關鍵基因與GC組織的表達和GC患者預后進行分析，為進一步探究GC發(fā)病機制和預后提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究資料基因表達數(shù)據(jù)庫GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是公共基因數(shù)據(jù)庫[8]。從中選取GSE54129 (GC組織111，正常組織21)、GSE29998 (GC組織50，正常組織49)和GSE19826 (GC組織12，正常組織15)3組數(shù)據(jù)作為研究對象，GSE54129和GSE19826兩組數(shù)據(jù)使用相同的基因測序平臺[ffymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array(GPL570平臺)]，GSE29998基因測序平臺為[Illumina HumanHT-12 V3.0 expression beadchip(GPL6947平臺)]。

1.2 差異表達基因的篩選利用GEO數(shù)據(jù)庫的在線分析工具GEOR2(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)對3組數(shù)據(jù)進行差異表達基因分析，篩選條件為|logFC|>1.5，校正后P<0.05。將logFC>1.5的基因作為上調(diào)差異表達基因(up-regulated differentially expressed genes，UDEGs)，logFC<-1.5的基因作為下調(diào)差異表達基因 (down-regulated differentially expressed genes，DDEGs) 。利用在線平臺Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制3組數(shù)據(jù)差異表達基因的韋恩圖，得到共有的差異表達基因。

1.3 差異表達基因的基因功能富集分析DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)是一個生物信息數(shù)據(jù)庫，也是一款在線免費分析軟件，其整合了生物學數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，幫助用戶從中提取生物學信息[9]。將篩選出的差異表達基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫進行GO分析，通過京都基因與KEGG進行信號通路分析。本研究定義P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義[10]。

1.4 PPI構(gòu)建和關鍵基因的篩選交互基因檢索工具(search tool for the retrieval of interacting gene，STRING，http://string.embl.de/)是研究蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫[11]，通過STRING構(gòu)建GCDEGs的PPI。應用Cytoscape軟件對PPI進行可視化分析，利用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件篩選關鍵基因。

1.5 關鍵基因的表達分析和驗證為明確關鍵基因在GC組織中的表達水平，利用基因表達譜交互分析(Gene Expression Profifiling Interactive Analysis，GEPIA, http://gepia.cancer-pku.cn)數(shù)據(jù)庫[12]進一步分析各關鍵基因在GC組織和正常組織中的差異表達，并應用Oncomine數(shù)據(jù)庫進一步驗證關鍵基因在GC組織中的表達水平[14]。

1.6 關鍵基因的預后分析和驗證Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(https://kmplot.com/analysis)可進行在線生存分析，數(shù)據(jù)庫包括21種腫瘤，如GC、乳腺癌、肝癌和肺癌等[13]。利用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫進一步分析關鍵基因與患者的總生存期(overall survival，OS)的關系，并應用GEPIA數(shù)據(jù)庫進一步驗證關鍵基因與患者預后的關系。

2 結(jié)果

2.1 GC組織和胃正常組織差異表達基因的篩選GSE54129中共篩選出胃癌和胃正常組織差異表達基因2 174個，其中上調(diào)基因1 035個，下調(diào)基因1 139個。GSE19826中共篩選出差異表達基因800個，其中上調(diào)基因245個，下調(diào)基因555個。GSE29998中共篩選出差異表達基因151個，其中上調(diào)基因62個，下調(diào)基因89個。將3組的差異表達基因通過在線平臺Draw Venn Diagram分析，得到差異表達基因32個，其中上調(diào)基因17個，下調(diào)基因15個，見圖1。

圖1 3組數(shù)據(jù)差異表達基因韋恩圖

2.2 差異表達基因的功能富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行GO分析和KEGG信號通路分析，GO分析包括生物學過程、細胞組成和分子功能。GO分析顯示，差異表達基因主要參與細胞外泌體和胞外區(qū)的細胞組成。KEGG信號通路分析顯示，差異表達基因主要參與構(gòu)建細胞外基質(zhì)受體相互作用、蛋白質(zhì)消化和吸收等通路。見表1。

表1 GC相關差異表達基因的功能富集分析

2.3 PPI構(gòu)建和關鍵基因的篩選將差異表達基因?qū)隨TRING平臺得到PPI圖，通過Cytoscape軟件對PPI圖進行可視化分析，見圖2。利用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件，通過此插件中的細節(jié)點柱形編碼(minutia cylinder-code，MCC)算法，得到前10位差異表達基因為COL1A1、COL1A2、COL5A2、BGN、COL12A1、THBS2、CDH11、CTHRC1、PRRX1、COL8A1。通過此插件中的分布式微型計算機數(shù)控(distributed microcomputer numerical control，DMNC)算法，得到前10位差異表達基因為COL12A1、CTHRC1、PRRX1、COL8A1、SULF1、THBS2、CDH11、COL5A2、TIMP1、BMP1，MCC算法和DMNC算法交互得到7個均為上調(diào)基因的關鍵基因：COL5A2、COL12A1、THBS2、CTHRC1、PRRX1、COL8A1、CDH11。

圖2 GC差異表達基因的PPI圖

2.4 關鍵基因的表達分析和驗證

2.4.1關鍵基因的表達分析 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫對關鍵基因進行表達分析。結(jié)果顯示，7個關鍵基因在GC組織當中均高表達，見圖3。

A. COL5A2基因；B. COL12A1基因；C.THBS2基因；D. CTHRC1基因；E. PRRX1基因；F. COL8A1基因；G. CDH11基因

2.4.2關鍵基因的表達驗證

2.4.2.1COL5A2基因在GC組織中的表達驗證 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫驗證COL5A2基因在GC組織中的表達水平，選擇Gui Gastric、Chen Gastric、Cho Gastric和DErrico Gastric 4個數(shù)據(jù)集來驗證COL5A2基因在GC組織和正常組織之間的表達水平。結(jié)果顯示，每個數(shù)據(jù)集中，COL5A2基因在GC組織中均高表達，見圖4。將4個數(shù)據(jù)集進行薈萃分析顯示，COL5A2基因在GC差異表達基因的中位秩為143，P為1.99×10-7，說明COL5A2基因在GC組織中高表達。

A. Gui Gastric(P=2.52×10-15，t=8.708)；B. Chen Gastric(P=2.05×10-17，t=12.611)；C. Cho Gastric(P=3.98×10-7，t=5.78)；D. DErrico Gastric(P=3.98×10-7，t=5.78)。

2.4.2.2COL12A1基因在GC組織中的表達驗證 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫驗證COL12A1基因在GC組織中的表達水平，選擇Gui Gastric、Chen Gastric、Cho Gastric和DErrico Gastric 4個數(shù)據(jù)集來驗證COL12A1基因在GC組織和正常組織之間的表達水平。結(jié)果顯示，每個數(shù)據(jù)集中，COL12A1基因在GC組織中均高表達，見圖5。將4個數(shù)據(jù)集進行薈萃分析顯示，COL12A1基因在GC差異表達基因的中位秩為67.5，P為8.12×10-9，說明COL12A1基因在GC組織中高表達。

A. Gui Gastric(P=1.69×10-10，t=6.714)；B. Chen Gastric(P=1.23×10-20，t=12.951)；C. Cho Gastric(P=1.61×10-8，t=6.849)；D. DErrico Gastric(P=2.47×10-12，t=5.575)。

2.4.2.3THBS2基因在GC組織中的表達驗證 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫驗證THBS2基因在GC組織中的表達水平，選擇Gui Gastric、Chen Gastric、Cho Gastric和DErrico Gastric 4個數(shù)據(jù)集來驗證THBS2基因在GC組織和正常組織之間的表達水平。結(jié)果顯示，每個數(shù)據(jù)集中，THBS2基因在GC組織中均高表達，見圖6。將4個數(shù)據(jù)集進行薈萃分析顯示，THBS2基因在GC差異表達基因的中位秩為181.5，P為7.08×10-7，說明THBS2基因在GC組織中高表達。

2.4.2.4CTHRC1基因在GC組織中的表達驗證 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫驗證CTHRC1基因在GC組織中的表達水平，選擇Gui Gastric、Chen Gastric、Cho Gastric和DErrico Gastric 4個數(shù)據(jù)集來驗證CTHRC1基因在GC組織和正常組織之間的表達水平。結(jié)果顯示，每個數(shù)據(jù)集中，CTHRC1基因在GC組織中均高表達，見圖7。將4個數(shù)據(jù)集進行薈萃分析顯示，CTHRC1基因在GC差異表達基因的中位秩為94.5，P為3.51×10-8，說明CTHRC1基因在GC組織中高表達。

A. Gui Gastric(P=1.4×10-6，t=4.912)；B. Chen Gastric(P=3.5×10-19，t=12.11)；C. Cho Gastric(P=1.18×10-8，t=6.811)；D. DErrico Gastric(P=1.24×10-8，t=7.199)。

A. Gui Gastric(P=3.83×10-10，t=6.592)；B. Chen Gastric(P=5.75×10-19，t=14.155)；C. Cho Gastric(P=6.98×10-8，t=6.208)；D. DErrico Gastric(P=3.78×10-9，t=7.711)。

2.4.2.5PRRX1基因在GC組織中的表達驗證 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫驗證PRRX1基因在GC組織中的表達水平，選擇Wang Gastric、Chen Gastric、Cho Gastric和DErrico Gastric 4個數(shù)據(jù)集來驗證PRRX1基因在GC組織和正常組織之間的表達水平。結(jié)果顯示，每個數(shù)據(jù)集中，PRRX1基因在GC組織中均高表達，見圖8。將4個數(shù)據(jù)集進行薈萃分析顯示，PRRX1基因在GC差異表達基因的中位秩為360.5，P為3.56×10-8，說明PRRX1基因在GC組織中高表達。

2.4.2.6COL8A1基因在GC組織中的表達驗證 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫驗證COL8A1基因在GC組織中的表達水平，選擇Gui Gastric、Wang Gastric和Cho Gastric 3個數(shù)據(jù)集來驗證COL8A1基因在GC組織和正常組織之間的表達水平。結(jié)果顯示，每個數(shù)據(jù)集中，COL8A1基因在GC組織中均高表達，見圖9。將3個數(shù)據(jù)集進行薈萃分析顯示，COL8A1基因在GC差異表達基因的中位秩為61，P為1.81×10-9，說明COL8A1基因在GC組織中高表達。

A. Wang Gastric(P=1.32×10-6，t=6.216)；B. Chen Gastric(P=1.17×10-9，t=7.859)；C. Cho Gastric(P=7×10-8，t=6.298)；D. DErrico Gastric(P=1.04×10-5，t=4.719)。

A. Wang Gastric(P=7.7×10-5，t=4.553)；B. Gui Gastric(P=1.81×10-9，t=6.252)；C. Cho Gastric(P=3.63×10-12，t=9.378)。

2.4.2.7CDH11基因在GC組織中的表達驗證 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫驗證CDH11基因在GC組織中的表達水平，選擇Gui Gastric、Chen Gastric、Cho Gastric和DErrico Gastric 4個數(shù)據(jù)集來驗證CDH11基因在GC組織和正常組織之間的表達水平。結(jié)果顯示，每個數(shù)據(jù)集中，CDH11基因在GC組織中均高表達(見圖10)，將4個數(shù)據(jù)集進行薈萃分析顯示，CDH11基因在GC差異表達基因的中位秩為65，P為2.4×10-9，說明CDH11基因在GC組織中高表達。

2.5 關鍵基因與GC患者的預后分析和驗證

2.5.1關鍵基因與GC患者的預后分析 利用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫進一步分析關鍵基因與患者的OS之間的關系。結(jié)果顯示，7個關鍵基因(COL5A2、COL12A1、THBS2、CTHRC1、PRRX1、COL8A1、CDH11)高表達患者的OS明顯短于低表達患者。見圖11。

A. Gui Gastric(P=1.17×10-10，t=6.799)；B. Chen Gastric(P=9.46×10-18，t=11.152)；C. Cho Gastric(P=4.79×10-9，t=6.929)；D. DErrico Gastric(P=2.11×10-9，t=7.36)。

A. COL5A2基因；B. COL12A1基因；C. THBS2基因；D. CTHRC1基因；E. PRRX1基因；F. COL8A1基因；G. CDH11基因。

2.5.2關鍵基因與GC患者預后的驗證 應用GEPIA數(shù)據(jù)庫進一步驗證關鍵基因與GC患者預后的關系。結(jié)果顯示，7個關鍵基因的表達情況與GC患者預后相關，即高表達患者的預后差。見圖12。

A. COL5A2基因；B. COL12A1基因；C. THBS2基因；D. CTHRC1基因；E. PRRX1基因；F. COL8A1基因；G. CDH11基因。

3 討論

近年來，隨著診療技術的進步，GC的治療方法也越來越多樣化。靶向治療直接作用于腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用的基因，為腫瘤的治療帶來新的希望[15]。這些關鍵基因參與了GC的發(fā)生發(fā)展過程，并且在GC的診斷和預后方面有著非常重要的意義。既往研究顯示，在GC患者中，THBS2高達患者的總生存期長于低表達患者[16]，但也有研究結(jié)果與之相反[17]。為進一步鑒別GC發(fā)生發(fā)展的關鍵基因，本研究利用生物信息學的方法，選取來自GEO數(shù)據(jù)庫的3個數(shù)據(jù)集進行分析，篩選和鑒別GC關鍵基因，并對關鍵基因在GC中的表達和對患者預后的影響進行分析和驗證。

本研究共得到32個差異表達基因，其中上調(diào)基因17個，下調(diào)基因15個。GO分析顯示，差異表達基因主要參與細胞外泌體和胞外區(qū)的細胞組成；KEGG信號通路分析顯示，差異表達基因主要參與構(gòu)建細胞外基質(zhì)受體相互作用、蛋白質(zhì)消化和吸收等通路，通過對差異表達基因參與的細胞組成和信號通路進一步分析，有助于認識GC發(fā)生發(fā)展的分子機制，為尋找新的治療靶點提供依據(jù)。

為進一步明確差異表達基因之間的相互作用，本研究通過STRING平臺構(gòu)建PPI圖，利用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件中的MCC算法和DMNC算法，得到7個關鍵基因，最后通過GEPIA數(shù)據(jù)庫、Oncomine數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫對關鍵基因的表達和影響預后能力進行分析和驗證。既往研究多是僅僅通過數(shù)據(jù)庫分析關鍵基因的表達和對患者預后的影響[18-19]，但本研究不僅對關鍵基因進行表達和預后分析，而且對結(jié)果進行了驗證，增加了研究結(jié)果的可靠性。本研究結(jié)果顯示，7個關鍵基因在GC組織中均高表達，且高表達患者的OS明顯短于低表達的患者。

COL5A2、COL12A1和COL8A1來自膠原蛋白家族，膠原蛋白為細胞外基質(zhì)的重要組成成分，其腫瘤微環(huán)境的調(diào)控發(fā)揮重要作用[20]。目前研究證實多種類型的膠原蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[21]。Ⅴ型膠原蛋白α2基因、Ⅻ型膠原蛋白α1基因和Ⅷ型膠原蛋白α1基因與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預后相關。有研究顯示，膀胱癌患者中COL5A2基因高表達且高表達預示著患者預后差[22]；COL12A1基因在結(jié)直腸癌中高表達且高表達患者的生存期短[23]；Peng等[24]研究顯示，乳腺癌中COL8A1基因高表達且高表達患者預后差。本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致，但上述基因在腫瘤中的潛在分子機制需要更多的研究以證實。

THBS2被認為可以阻止腫瘤血管生長，阻止腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[25]。既往研究顯示，GCTHBS2高表達患者預后好于低表達患者，但本研究得到的結(jié)論與之相反，說明需進一步研究THBS2基因與GC患者臨床預后的關系。

CTHRC1基因定位于人類染色體上，它不僅參與心血管系統(tǒng)的發(fā)育、自身免疫性反應等過程，同時還能影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[26]。CTHRC1基因通過改變腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)展[27]。有研究顯示CTHRC1在GC組織中高表達，且高表達患者預后差[28]，與本研究結(jié)論一致。

PRRX1基因編碼的蛋白位于細胞核內(nèi)，是腫瘤發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要轉(zhuǎn)錄因子，PRRX1的異常表達可通過TGF-β/Smad、Wnt/β-cantinne、p53等信號通路促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[29]。Zhang等[30]研究顯示，PRRX1在GC組織中高表達，且高表達患者預后差。CDH11主要介導同種細胞黏附，有研究顯示，CDH11參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在腫瘤進展中起著關鍵作用[31]。Chen等[32]研究顯示，CDH11與GC患者的預后相關，且CDH11高表達患者預后差。

綜上所述，通過生物信息學的方法得到的7個關鍵基因，可能為GC診斷和預后的潛在生物標志物，但其作用機制還需進一步研究。