血紅素加氧酶?1修飾的骨髓間充質干細胞減輕脂多糖誘導的肺微血管內皮細胞氧化應激

陳旭昕 李虎明 唐儉 孟激光 韓志海

1中國人民解放軍總醫院第六醫學中心呼吸與危重癥醫學科（北京100048）；2中國人民解放軍總醫院呼吸與危重癥醫學部（北京100091）

彌漫性肺血管內皮細胞損傷是急性肺損傷（acute lung injury，ALI）及急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）重要的病理特征。肺微血管內皮細胞（pulmonary micro?vascular endothelial cell，PVEC）損傷后可導致肺泡毛細血管通透性增加及肺水腫的發生，其中氧化應激是導致肺血管內皮細胞損傷的重要機制之一［1-2］。研究［3-5］表明，骨髓間充質干細胞（bone marrow?derived mesenchymal stem cell，BM?MSC）對急性肺損傷具有保護作用。逆轉ALI/ARDS 中的氧化應激失衡是MSC 發揮保護作用的重要機制，但肺損傷微環境中增高的氧化應激水平也明顯制約了外部間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）的損傷修復作用［6］。血紅素加氧酶?1（Heme oxygenase?1，HO?1）是一種誘導性應激蛋白，具有在病理狀態下穩定內環境以及細胞保護功能［7］。HO?1 可通過減少活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生，減少組織脂質過氧化以及促進抗氧化效應元件來發揮抗氧化應激作用［8］。上調BM?MSC 中HO?1 的表達，能否解除氧化應激對于間充質干細胞本身的影響，能否進一步提升MSC 對ALI 及靶細胞氧化應激的保護作用有待進一步研究證實。因此，本研究擬利用Transwell 共培養體系，用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激PVEC，比較MSC 及HO?1 修飾的MSC 對PVEC 內氧化應激平衡，包括ROS含量、脂質過氧化物（lipid peroxide，LPO）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH?PX）活性的影響，并探索MSC 調控PVEC 氧化應激平衡可能的分子機制，以期為MSC 在ALI/ARDS 治療中的應用提供更多的實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑大鼠源性的BM?MSC 細胞由本室保存，HO?1 修飾的大鼠源性BM?MSC 即穩定過表達HO?1 的MSC（MSC?HO?1）由本室建立，并完成細胞免疫表型及多能分化潛能鑒定［9］。人源性PVEC 細胞來源于美國模式培養物集存庫。LPS（Ecoil 0111：B4）及HO?1 活性檢測試劑盒購于美國Sigma。DMEM/F12 培養基和優質胎牛血清均購于GIBCO 公司。兔抗人HO?1 單克隆抗體、考馬斯亮藍蛋白質濃度測定試劑盒、RIPA 細胞裂解液、總蛋白提取試劑盒及活性氧（ROS）檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司。LPO、MDA 水平及SOD、GSH?PX 活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。兔抗人β?actin 多克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的大鼠抗兔多克隆抗體（二抗）均購自Santa Cruz 公司。ECL?PLUS 發光試劑盒及蛋白Marker 均 購自Thermo Fisher 公 司。Transwell 細 胞共培養板（含0.4 μm 孔徑濾膜）購置美國康寧公司。其他生化試劑均為進口或國產分析純。

1.2 細胞培養大鼠BM?MSC、MSC?HO?1 及人源性PVEC 細胞均培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養基中，培養條件為：37 ℃、5% CO2及95%濕度。隔1 d換液1次，2～3 d傳代1次。實驗用細胞均處于對數生長期。

1.3 細胞共培養及分組處理MSC 或MSC?HO?1與PVEC 細胞共培養于Transwell 共培養體系中。Transwell 體系的上室接種MSC 或MSC?HO?1（1 ×105/孔），而在下室接種PVEC（2 × 103/孔），建立共培養體系，培養條件同上。實驗共分4 組：A 組，PVEC+LPS 組，PVEC 細胞常規培養并給予終濃度為0.1 mg/mL 的LPS 刺激6 h［10］；B 組：PVEC/MSC+LPS 組，PVEC 細胞與MSC 共培養于Transwell 體系過夜后給予終濃度為0.1 mg/mL 的LPS 刺激6 h；C 組：PVEC/MSC?HO?1+LPS 組，PVEC 與MSC?HO?1細胞共培養于Transwell 體系過夜后給予終濃度為0.1 mg/mL 的LPS 刺激6 h；D 組：正常PVEC 組，常規培養PVEC 細胞并不予以任何處理。

1.4 PVECs 內ROS 水平檢測采用DCFH?DA 法檢測細胞內ROS 水平，根據上海碧云天生物公司活性氧檢測試劑盒說明書進行操作。各組共培養細胞，取出Transwell 嵌套，吸出下室培養液，加入0.25%胰蛋白酶消化PVECs，并加入小牛血清終止消化，PBS 洗滌兩次后離心收集PVECs；將活性氧檢測試劑盒中的DCFH?DA 按1∶1 000 無血清培養液稀釋，細胞樣本懸浮于稀釋好的DCFH?DA 中，調節細胞濃度為1 × 106/mL，37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，每隔5 min 輕輕顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸；用無血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DCFH?DA；再用PBS 清洗2 次。流式細胞儀測量熒光強度（488 nm 激發波長，525 nm 發射波長），Flowjo 軟件分析數據。

1.5 PVECs 內LPO、MDA 水平及SOD、GSH?PX活性檢測同上收集各組PVECs，采用硫代巴比妥酸法檢測LPO 及MDA 水平，采用黃嘌呤氧化法檢測SOD 活性，采用二硫代對硝基苯甲酸直接法檢測GSH?PX 活性，均按照南京建成生物工程研究所試劑盒附帶的說明書進行操作。蛋白濃度測定按碧云天生物技術公司說明書采用考馬斯亮藍法檢測PVEC 內蛋白含量。

1.6 PVECs 內HO?1 蛋白水平檢測同上收集各組PVECs，用總蛋白提取試劑盒提取細胞的總蛋白，考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度后，以β?actin 為內參照，取20 μg 樣品依次行SDS?PAGE 電泳、電轉至PVDF 膜，經過脫脂牛奶封閉后，依次加入第一抗體、第二抗體，ECL 發光液中顯色。放入GBOX?HR 凝膠成像分析系統中進行攝像分析。

1.7 PVECs 內HO?1 活性檢測同上收集各組PVECs，加入RIPA 細胞裂解液，收集上清，按照HO?1 活性檢測試劑盒操作。反應總體積200 μL，加入還原型輔酶Ⅱ后反應即開始，37 ℃避光反應1 h 置于冰上終止反應。用1 倍體積的氯仿萃取，獲得上清，采用分光光度計測定464 nm 和530 nm波長處的吸光度值，計算HO?1 活性。

1.8 統計學方法采用SPSS 16.0 統計軟件進行分析。所有數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK 檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSCs?HO?1 共培養減少PVECs 中ROS 的產生在A組中，PVECs受LPS刺激后，PVECs內ROS含量顯著增加，與其余組別相比差異有統計學意義（P<0.05）；而與A 組相比，在B 組中即與MSC 共培養后，可減少LPS誘導的ROS生成，與MSC?HO?1共培養后（C 組），可進一步減少LPS 刺激的ROS 生成，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1、圖1。

圖1 流式細胞儀檢測各組PVECs 內ROS 含量Fig.1 Analysisof the ROS levels in PVECs by flow cytometry

表1 各組PVECs 內ROS 含量Tab.1 The intracellular accumulation of ROS in PVECs±s

表1 各組PVECs 內ROS 含量Tab.1 The intracellular accumulation of ROS in PVECs±s

注：與A 組比較，*P<0.05；與B 組比較，#P<0.05；與D 組比較，△P<0.05

組別A 組（PVEC+LPS）B 組（PVEC/MSC+LPS）C 組（PVEC/MSC?HO?1+LPS）D 組（PVEC）F 值例數3 3 3 3 ROS（channel number）875.63±40.08△320.39±10.81*△123.50±16.48*#60.30±4.92*272.20

2.2 MSCs?HO?1 共培養減少PVECs 中LPO 及MDA 的產生在A 組中，PVECs 受LPS 刺激后，PVECs 內LPO 及MDA 水平顯著增加，與其余組別相比差異均有統計學意義（P< 0.05）；而與A 組相比，在B 組中即與MSC 共培養后，可減少LPS 誘導的LPO 及MDA 的產生，而與MSC?HO?1 共培養后（C 組），可進一步減少LPS 刺激的LPO 及MDA 的產生，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 各組PVECs 內LPO 及MDA 水平Tab.2 The levels of LPO and MDA in PVECs±s

表2 各組PVECs 內LPO 及MDA 水平Tab.2 The levels of LPO and MDA in PVECs±s

注：與A 組比較，*P<0.05；與B 組比較，#P<0.05；與D 組比較，△P<0.05

組別A組（PVEC+LPS）B組（PVEC/MSC+LPS）C組（PVEC/MSC?HO?1+LPS）D組（PVEC）F值例數3 3 3 3 LPO（nmol/gprotein）1.16±0.01△0.30±0.004*△0.22±0.02*#△0.11±0.02*842.83 MDA（nmol/gprotein）21.30±1.43△8.89±0.20*△3.17±0.70*#0.22±0.10*133.31

2.3 MSCs?HO?1 共培養增加PVECs 中SOD 及GSH?PX 的活性PVECs 給予LPS 刺激后，細胞內SOD 及GSH?PX 活性顯著下降，與其余組別相比差異均有統計學意義（P<0.05）；而與A組相比，與MSC共培養后（B組），可增加SOD及GSH?PX 活性，而與MSC?HO?1 共培養后（C 組），可進一步提高SOD 及GSH?PX活性，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

表3 各組PVECs 內SOD 及GSH?PX 活性Tab.3 The activities of SOD and GSH?PX in PVECs ±s

表3 各組PVECs 內SOD 及GSH?PX 活性Tab.3 The activities of SOD and GSH?PX in PVECs ±s

注：與A 組比較，*P<0.05；與B 組比較，#P<0.05；與D 組比較，△P<0.05

組別A組（PVEC+LPS）B組（PVEC/MSC+LPS）C組（PVEC/MSC?HO?1+LPS）D組（PVEC）F值例數3 3 3 3 SOD（U/mg protein）10.35±1.07△17.01±0.48*△36.97±2.10*#△50.30±0.59*218.770 GSH?PX（U/mg protein）28.60±8.20△151.89±1.72*△1 045.00±31.91*#△1 464.00±61.42*398.023

2.4 MSCs?HO?1 共培養促進PVECs 中HO?1 的表達正常PVECs 內HO?1 蛋白表達相對較低，給予LPS 刺激后HO?1 的表達可顯著上調（A 組），差異有統計學意義（P< 0.05）；在B 組中，PVECs 內HO?1 的表達被MSC 共培養上調，而與MSC?HO?1共培養后，PVECs 內HO?1 的表達被進一步上調，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2。

圖2 各組PVECs 內HO?1 Western blot 分析Fig.2 Western blot analysis of HO?1 protein expression in PVECs

2.5 MSCs?HO?1 共培養促進PVECs 中HO?1 的活性正常PVECs 內HO?1 活性相對較低（D 組），給予LPS 刺激后HO?1 的活性上調（A 組），差異有統計學意義（P< 0.05）；在B 組中，PVECs 內HO?1的活性被MSC 共培養上調，而與MSC?HO?1 共培養后，PVECs 內HO?1 的活性被進一步上調，差異有統計學意義（P<0.05），見表4。

表4 各組PVECs 內HO?1 活性比較Tab.4 The activities of HO?1 in PVECs ±s

表4 各組PVECs 內HO?1 活性比較Tab.4 The activities of HO?1 in PVECs ±s

注：與A 組比較，*P < 0.05；與B 組比較，#P < 0.05；與D 組比較，△P<0.05

組別A 組（PVEC+LPS）B 組（PVEC/MSC+LPS）C 組（PVEC/MSC?HO?1+LPS）D 組（PVEC）F 值例數3 3 3 3 HO?1（pmol·mg?1·h?1）289.67±8.19△670.00±48.74*△1 100.00±57.73*#33.33±2.60*149.56

3 討論

氧化應激是指機體內氧化和抗氧化兩個系統失去平衡，當機體內氧化系統增強或抗氧化系統減弱即會出現氧化應激現象［11-12］。本研究結果顯示：與BM?MSC 比較，經HO?1 修飾的BM?MSC（MSC?HO?1）可以進一步減輕LPS 誘導的PVEC 細胞的氧化應激反應，其機制可能與上調PVEC 細胞內HO?1表達有關。

氧化系統主要包括ROS、LPO、MDA 和活性氮族等，抗氧化系統主要包括SOD、GSH?PX 和谷胱甘肽轉移酶等［13］。生理情況下，ROS 等活性自由基具有殺滅病原體、清除腫瘤細胞和凋亡細胞的作用，但如果在病理狀態下，ROS 等產生過量，同時抗氧化系統無法抵消時就會引發氧化應激，繼而導致細胞、組織損傷。在ALI/ARDS 的發生發展過程中，氧化應激會導致肺血管內皮細胞凋亡、損傷，從而使肺的毛細血管通透性增加，引發肺水腫及頑固性低氧［14-15］。本研究表明，PVEC 與MSC 共培養后可以減少LPS 誘導的ROS、LPO 及MDA 的產生，并增加抗氧化物質SOD 及GSH?PX 的活性。而PVEC 與經HO?1 修飾的BM?MSC 即MSC?HO?1共培養后，則可以進一步減少LPS誘導的ROS、LPO及MDA 的產生，并進一步增加抗氧化物質SOD 及GSH?PX 的活性。這一結果提示MSC?HO?1 與MSC相比，MSC?HO?1 對改善LPS 誘導PVEC 細胞氧化應激反應的改善作用更為明顯，具體表現為進一步抑制了氧化物質的產生并進一步促進了抗氧化物質的生成。

血紅素加氧酶系統包括三種異構體，即HO?1、HO?2 及HO?3［16］。與其他HO 異構體不同，HO?1 是屬于誘導應激蛋白，能被氧化物質及炎癥因子誘導表達［16］。內源性的HO?1 廣泛表達于多種細胞內，具有維持內環境穩定及細胞保護作用，在過度炎癥和氧化應激相關的疾病中起著重要的作用［17-18］。研究表明，過表達HO?1 可以減少細胞因子及ROS的產生，從而減少中性粒細胞浸潤及拮抗氧化應激反應。本研究結果顯示，給予LPS 刺激后可以誘導PVEC 細胞內HO?1 表達增加，這屬于細胞正常的應激反應。而與MSC 及MSC?HO?1 共培養后，可進一步上調PVECs內HO?1的表達，而MSC?HO?1共培養可使PVECs 內HO?1 表達上調更為明顯。MSC 的旁分泌機制目前被認為是其發揮細胞保護作用及免疫調控效應的主要機制，如何通過基因修飾增強MSC 的旁分泌效應是近年的研究熱點［19］。HO?1 屬于非外泌性蛋白，其增強MSC 旁分泌效應的機制尚不清楚，可能與促進白介素?10、肝細胞生長因子及角質化細胞生長因子的外泌有關［9-10］。這些細胞因子可作用于PVEC 而提升PVEC 抵抗氧化應激的能力包括抑制氧化物質及促進抗氧化物質和應激保護性蛋白HO?1 的表達。因此，筆者推測MSC?HO?1 調控PVEC 內氧化應激的機制可能與上調PVEC 中HO?1 表達相關。調控HO?1 表達所涉及的信號通路眾多，比如絲裂素活化蛋白激酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C 和磷脂酰肌醇3?激酶等［20］，MSC?HO?1 到底通過分泌細胞因子以及通過何種信號通路上調PVECs 內HO?1 的表達尚待進一步實驗研究。

ALI/ARDS，尤其內毒素性ALI/ARDS 以炎癥失控及氧化應激失衡為主要特征［9-10］，在惡劣的局部微環境中氧化應激損傷成為制約MSC 發揮有益效應的重要瓶頸［9］。過表達HO?1 可提升MSC“應對”局部惡劣微環境的能力［20-21］，增強MSC 的旁分泌效應進而發揮保護靶細胞的作用。本研究結果顯示，MSC?HO?1 可顯著改善LPS 誘導的PVECs 氧化應激失衡，其機制可能與上調PVECs 內HO?1 表達有關，具體的分子機制尚需進一步研究。