靶向金納米棒聯(lián)合納秒脈沖電場(chǎng)對(duì)體外A375黑色素瘤2D模擬組織的消融效果研究

米 彥 代璐健 劉 權(quán) 張 倩 唐均英

（1. 輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶大學(xué)） 重慶 400030 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 重慶 400016）

0 引言

納秒脈沖電場(chǎng)（nanosecond Pulsed Electric Fields, nsPEF）是一種在不使用有毒化療藥物的情況下實(shí)現(xiàn)腫瘤有效治療的新型物理療法[1]。由于其脈沖寬度窄，nsPEF可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)電效應(yīng)，發(fā)生程序性死亡，即凋亡，而且該方法在治療期間溫升較低，從而不存在熱安全性風(fēng)險(xiǎn)[2]。但是，由于過窄的脈沖寬度，在nsPEF治療期間需要高電場(chǎng)強(qiáng)度才能有效殺死腫瘤細(xì)胞。但過高的電場(chǎng)強(qiáng)度可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤組織表面意外放電[3]，并發(fā)生局部灼傷，這給nsPEF治療帶來了一定的安全性問題。

近年來，金納米棒作為一種高電導(dǎo)率的納米材料已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有增強(qiáng)脈沖電場(chǎng)生物電效應(yīng)的功 能[4-8]，這為改善傳統(tǒng)nsPEF治療腫瘤的電氣安全性問題提供了新的可能性。許多學(xué)者首先研究了金納米棒在體內(nèi)的生物安全性問題，大量研究表明，安全濃度范圍內(nèi)的金納米棒在體內(nèi)沒有明顯的毒副作 用[9-10]，并且在一定時(shí)間后能夠通過身體的新陳代謝排出體外[11-12]。在以上研究的基礎(chǔ)上，國(guó)內(nèi)外大量學(xué)者基于金納米棒的導(dǎo)電特性進(jìn)行了相關(guān)仿真與實(shí)驗(yàn)研究。Huang Shuyan等研究證明，金納米粒子能夠使局部電場(chǎng)強(qiáng)度發(fā)生畸變，從而增大電場(chǎng)強(qiáng)度，但是由于納米粒子尺寸過小，導(dǎo)致加入金納米粒子對(duì)整體細(xì)胞溶液的電場(chǎng)分布影響不大[13]。通過有限元仿真，Qiu Hao等發(fā)現(xiàn)高電導(dǎo)率金納米粒子可以增強(qiáng)脈沖電場(chǎng)的作用，并明顯提高了細(xì)胞膜的跨膜電位和穿孔密度[4]。A. Rolong等也通過有限元仿真研究了導(dǎo)電納米粒子和微秒脈沖電場(chǎng)聯(lián)合對(duì)組織消融的影響。研究結(jié)果表明，導(dǎo)電納米粒子的加入能夠擴(kuò)大組織的消融面積，降低消融組織所需的最低閾值電場(chǎng)強(qiáng)度[5]。A. Ghorbel等通過實(shí)驗(yàn)和仿真共同研究了導(dǎo)電納米粒子和非導(dǎo)電納米粒子對(duì)細(xì)胞電穿孔效應(yīng)的影響，結(jié)果表明，導(dǎo)電納米粒子比非導(dǎo)電納米粒子具有更強(qiáng)的增強(qiáng)效果。除此之外，當(dāng)納米粒子更多地聚集在細(xì)胞膜周圍時(shí)，增強(qiáng)效果更加明顯[6]。類似的一些實(shí)驗(yàn)研究同樣也驗(yàn)證了金納米粒子的確能夠明顯地增強(qiáng)電穿孔效應(yīng)[7-8]，但是這些實(shí)驗(yàn)和仿真研究更多的是集中于電轉(zhuǎn)染領(lǐng)域，鮮有關(guān)于金納米粒子與nsPEF聯(lián)合的研究。

在現(xiàn)有研究的指導(dǎo)下，高電導(dǎo)率且具有靶向結(jié)合功能的納米粒子是首選。葉酸（Folic Aicd, FA）受體廣泛地表達(dá)于各種腫瘤細(xì)胞表面[14]。在光熱療法的研究中，F(xiàn)A修飾后的金納米棒由于能夠靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞，因此，比未修飾的金納米棒具有更強(qiáng)的抗腫瘤功效[15]。Chen Zhongjian等開發(fā)了一種葉酸修飾的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，用于靶向A375黑色素瘤細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α 傳遞[16]。葉酸修飾后的脂質(zhì)體由于能夠主動(dòng)與A375細(xì)胞結(jié)合，具有更高的傳遞效率，從而實(shí)現(xiàn)更好的腫瘤抑制效果。因此，本文也選用葉酸這一常用的靶向配體來修飾金納米棒，從而實(shí)現(xiàn)金納米棒在細(xì)胞周圍的有效聚集，提高細(xì)胞的電穿孔效應(yīng)。

基于本課題組的前期研究[17-18]，葉酸靶向金納米棒可以在較低的電場(chǎng)強(qiáng)度下實(shí)現(xiàn)更高的腫瘤殺傷效果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證并探討該方法的實(shí)驗(yàn)效果，本文從實(shí)際情況出發(fā)，討論了該方法的可行性。本文將高生物相容性的GNR-PEG表面進(jìn)行FA修飾（Folic Acid-polyethylene Glycol-gold Nanorods, GNR-PEG-FA），使其能夠有效地與A375黑色素瘤細(xì)胞結(jié)合[19-20]，并通過暗場(chǎng)顯微鏡對(duì)細(xì)胞和金納米棒的結(jié)合進(jìn)行觀察。本文在確定其靶向結(jié)合作用后，通過使用calcein-AM試劑染色和熒光顯微鏡觀察，研究了不同脈沖參數(shù)（電壓、脈沖寬度和脈沖個(gè)數(shù)）作用下對(duì)2D模擬組織消融面積的影響。通過將Comsol有限元仿真得到的電場(chǎng)強(qiáng)度分布圖與消融圖進(jìn)行擬合，從而直觀地展現(xiàn)實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞有效殺傷的閾值電場(chǎng)強(qiáng)度大小。最后，本文分析和對(duì)比了不同脈沖參數(shù)下消融面積和閾值電場(chǎng)強(qiáng)度的變化規(guī)律，并分析了GNR-PEG-FA增強(qiáng)細(xì)胞電穿孔的機(jī)制，為nsPEF治療腫瘤提供一種新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 體外2D模擬組織培養(yǎng)

人黑色素瘤A375細(xì)胞系獲自第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究院。細(xì)胞在含有10%的血清和1%抗生素的青霉素-鏈霉素的高糖DMEM（dulbecco's modified eagle medium）培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并在5%的CO2和37℃濕潤(rùn)環(huán)境中孵育。

實(shí)驗(yàn)前，將A375細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中消化，以800r/min的速度離心5min，然后以1.5×106個(gè)細(xì)胞/mL的濃度接種到35mm培養(yǎng)皿中24h。當(dāng)細(xì)胞匯合度接近100%時(shí)，即形成了致密的2D體外細(xì)胞模擬組織，隨后將被用于nsPEF實(shí)驗(yàn)。

1.2 靶向金納米棒的表征與暗場(chǎng)成像

GNR-PEG-FA購(gòu)于西安瑞禧生物科技有限公司，通過TECNAI G2 F20 S-TWIN透射電鏡（FEI, USA）和Cary60紫外-可見光分光光度計(jì)（Agilent, USA）分別對(duì)GNR-PEG-FA進(jìn)行透射電鏡觀察和吸收光譜的測(cè)定。

暗場(chǎng)成像之前，將在24mm蓋玻片上預(yù)先孵育生長(zhǎng)了24h的A375細(xì)胞從孵箱中取出，用磷酸緩沖液輕輕清洗蓋玻片表面兩次，然后將0.1mg/mL的GNR-PEG-FA溶液（基于本課題組的前期研究[21]，0.1mg/ml是材料的安全濃度）加入到培養(yǎng)基中與細(xì)胞共同孵育15min。隨后，用磷酸緩沖液輕輕沖洗3次以去除未與細(xì)胞結(jié)合的金納米棒，之后使用多聚甲醛固定，甘油包被，并用另一個(gè)蓋玻片進(jìn)行密封。最后，通過配備有暗視場(chǎng)聚光鏡（U-DCW，1.2-1.4）的BX51光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯，日本）觀察GNR-PEG-FA和A375黑素瘤細(xì)胞溶液。

1.3 nsPEF實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)波形和裝置示意圖分別如圖1和圖2所示。圖1中，nsPEF單獨(dú)作用及和GNR- PEG-FA曲線均為電流曲線。納秒脈沖發(fā)生器的輸出連接到兩個(gè)直徑為1mm的銅針電極，電極中心之間的距離為3mm。在nsPEF處理之前，將具有A375黑色素瘤2D模擬組織的不同培養(yǎng)皿分為單獨(dú)nsPEF組（不含GNR-PEG-FA）和GNR-PEG-FA組（含GNR-PEG-FA）兩組。在實(shí)驗(yàn)過程中，將針狀電極插入到培養(yǎng)皿中，并施加相應(yīng)的納秒脈沖進(jìn)行處理。

本研究使用了自制的模塊化高壓納秒脈沖發(fā)生 器[21]。納秒脈沖電場(chǎng)參數(shù)見表1。表中，U為脈沖電壓，τ為脈沖寬度，N為脈沖個(gè)數(shù)，每個(gè)參數(shù)均 設(shè)有5個(gè)水平值，當(dāng)變化其中一個(gè)脈沖參數(shù)時(shí)，另外兩個(gè)脈沖參數(shù)均固定為中間值，脈沖重復(fù)頻率均為1Hz。例如，當(dāng)變化不同脈沖電壓時(shí)，脈沖個(gè)數(shù)固定為100個(gè)，脈沖寬度固定為300ns，其余參數(shù)設(shè)置以此類推。

綜上所述，打孔注藥防治黃斑星天牛不但防治效果好，不污染環(huán)境，不殺傷天敵，且用藥量少，成本低，在通常情況下建議使用氧化樂果，既節(jié)約又有效，可大面積推廣使用，對(duì)受害嚴(yán)重的也可以進(jìn)行3次注藥防治。

圖1 實(shí)驗(yàn)波形 Fig.1 Experimental waveforms

圖2 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖 Fig.2 Schematic of experimental setup

1.4 Calcein-AM染色檢測(cè)消融面積

在GNR-PEG-FA聯(lián)合nsPEF處理完A375細(xì)胞后，從培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng)基，并將1mL新鮮培養(yǎng)基添加到培養(yǎng)皿中，然后放置在37℃的孵箱下孵育3h。 3h后，除去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，并用PBS（phosphate buffer saline）輕輕洗滌細(xì)胞3次。隨后，將1mL于避光環(huán)境下配制而成的鈣黃綠素溶液PBS與鈣黃綠素-AM的體積稀釋比為250∶1（Dojindo, 日本）添加到培養(yǎng)皿中，于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)30min。30min后，吸出培養(yǎng)皿中的鈣黃綠素溶液，將細(xì)胞用PBS輕輕洗滌兩次，然后加入1mL制備的PI（propidium iodide）溶液（PBS與PI的稀釋比為100∶1）（Dojindo, 日本），放入孵箱中孵育5min。5min后，將培養(yǎng)皿用PBS輕輕洗滌一次，然后再加入1mL新鮮培養(yǎng)基，最后在避光條件下用熒光顯微鏡（DMi8，Leica，德國(guó)）觀察細(xì)胞。Leica LAS AF Lite軟件將Calcein-AM和PI染色的最終成像結(jié)果合并。

表1 納秒脈沖電場(chǎng)參數(shù) Tab.1 Parameters of nsPEF

1.5 空間電場(chǎng)分布仿真

COMSOL Multiphysics 5.4a是一種基于有限元分析法進(jìn)行多物理場(chǎng)仿真模擬的常用軟件。本文使用該軟件進(jìn)行仿真，并用于分析電極周圍的電場(chǎng)強(qiáng)度分布。電場(chǎng)分布的仿真模型和空間分布的結(jié)果分別如圖3和圖4所示。如圖3所示，模型的求解域是直徑為35mm的圓形區(qū)域（對(duì)應(yīng)于實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)皿），中間為兩個(gè)中心間距為3mm、直徑為1mm的圓形針電極（對(duì)應(yīng)于實(shí)際實(shí)驗(yàn)中使用的電極針）。 含與不含GNR-PEG-FA細(xì)胞溶液的電導(dǎo)率通過計(jì)算后分別設(shè)定為1S/m和1.047S/m，電極材料選用軟件中預(yù)設(shè)的銅材料。

圖3 空間電場(chǎng)分布仿真的網(wǎng)格模型 Fig.3 Meshing model of simulation of space electric field strength

圖4 電場(chǎng)強(qiáng)度分布結(jié)果 Fig.4 Distribution of electric field strength

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用OriginPro軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均用x（均值）±s（標(biāo)準(zhǔn)差）表示，利用單因素方差分析方法評(píng)估實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性差異，其中，*p＜0.05和**p＜0.01分別表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異和極顯著性差異。本文采用單因素方差分析方法比較處理組之間實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同。

2 結(jié)果

2.1 GNR-PEG-FA的表征與暗場(chǎng)成像

GNR-PEG-FA的表征與A375細(xì)胞的暗場(chǎng)成像如圖5所示。如圖5a所示，本文所使用的GNR- PEG-FA外徑約為15nm，長(zhǎng)度約為60nm，縱橫比約為4。金納米棒作為一種金屬納米材料，由于獨(dú)特的棒狀結(jié)構(gòu)以及具有的局部表面等離子體共振的特性，使得其在暗場(chǎng)成像中具有很大的優(yōu)勢(shì)[22-23]。金納米棒的局部表面等離子體共振分為橫向表面等離子體共振（Transverse Surface Plasmon Resonance, TSPR）和縱向表面等離子體共振（Longitudinal Surface Plasmon Resonance, LSPR）兩種模式，反映在GNR-PEG-FA紫外-可見光吸收光譜上是兩個(gè)吸收峰。其中，強(qiáng)度較小的吸收峰（520nm）對(duì)應(yīng)TSPR，強(qiáng)度較大的吸收峰（830nm）對(duì)應(yīng)LSPR。在暗場(chǎng)顯微鏡中，一束傾斜入射的狹窄的白光射向金納米棒，由于白光的波長(zhǎng)覆蓋了可見光波長(zhǎng)的范圍，因此，當(dāng)金納米棒發(fā)生表面等離子體共振對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)如果在可見光范圍內(nèi)，則會(huì)被白光激發(fā)產(chǎn)生局部等離子體共振，從而發(fā)生光的強(qiáng)烈的散射或吸收。從紫外可見吸收光譜（見圖5b）可以看出，最強(qiáng)LSPR吸收峰最強(qiáng)的位置位于波長(zhǎng)為830nm處，已經(jīng)超出了可見光波長(zhǎng)（380～780nm）的范圍，因此，無法通過暗場(chǎng)顯微鏡觀察到GNR-PEG-FA最強(qiáng)烈的散射光。但是，在LSPR峰的上升沿前部有一段處于可見光的紅光范圍內(nèi)，而且該范圍內(nèi)的強(qiáng)度與TSPR峰（520nm，綠光）的強(qiáng)度十分接近，因此，在暗場(chǎng)顯微觀察中將會(huì)收集到強(qiáng)度接近的紅光和綠光。通常來說，紅光與綠光混合進(jìn)入人眼時(shí)，眼睛會(huì)將其識(shí)別為黃色，這解釋了圖5c中金納米棒顯示為黃色的原因。

圖5 GNR-PEG-FA的表征與A375細(xì)胞的暗場(chǎng)成像 Fig.5 Characterization of GNR-PEG-FA and dark field imaging of A375 cells

由于葉酸受體是A375細(xì)胞的一種良好的靶向識(shí)別物[24-26]，因此本文也選用了葉酸作為金納米棒的靶向修飾物。圖5c的暗場(chǎng)成像結(jié)果表明，大量的GNR-PEG-FA聚集在A375細(xì)胞周圍，進(jìn)一步證明了GNR-PEG-FA與A375細(xì)胞確實(shí)存在靶向結(jié)合的效果。除此之外，由于葉酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[25-27]，一部分GNR-PEG-FA也進(jìn)入到了細(xì)胞內(nèi)部，而不是僅僅分布在細(xì)胞膜周圍。總之，無論是金納米棒位于細(xì)胞膜表面還是細(xì)胞內(nèi)部，均為增強(qiáng)nsPEF對(duì)A375細(xì)胞電穿孔效應(yīng)提供了幫助。

2.2 GNR-PEG-FA聯(lián)合nsPEF對(duì)消融面積的影響

圖6 不同脈沖電壓下nsPEF聯(lián)合或者不聯(lián)合GNR-PEG-FA對(duì)消融面積的影響 （比例尺=0.5μm，*p＜0.05，**p＜0.01） Fig.6 Ablation area under different applied voltages after nsPEF treatment with or without GNR-PEG-FA (scale bar=0.5μm, *p＜0.05, **p＜0.01)

在nsPEF處理后3h，通過熒光顯微鏡觀察消融區(qū)域。如圖6～圖8所示，分別為不同脈沖電壓、 脈沖寬度和脈沖個(gè)數(shù)作用下的消融結(jié)果，其中，活細(xì)胞將會(huì)被鈣黃綠素染色，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色，而圖中黑色的部分代表此處的腫瘤細(xì)胞已經(jīng)被消融，即消融區(qū)域（電極劃痕部分沒有被計(jì)算入消融面積中）。如圖6所示為不同脈沖電壓對(duì)消融面積的影響，隨著脈沖電壓的上升，消融面積呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)。當(dāng)nsPEF單獨(dú)作用時(shí)，消融面積從1 000V時(shí)的0.387mm2增加到2 000V時(shí)的7.704mm2，而GNR-PEG-FA組的消融面積從約0.677mm2增加到8.627mm2。相同脈沖電壓作用下，含有納米粒子的實(shí)驗(yàn)組與僅有脈沖電壓作用的實(shí)驗(yàn)組相比，消融面積增幅比例范圍為12%～75%。在所有的實(shí)驗(yàn)電壓下，GNR-PEG-FA組的消融面積均比nsPEF單獨(dú)作用組的消融面積大，且具有顯著性差異（*p＜0.05或**p＜0.01），顯著性差異指實(shí)驗(yàn)組之間消融面積的統(tǒng)計(jì)分析。

圖7 不同脈沖寬度下nsPEF聯(lián)合或者不聯(lián)合GNR-PEG-FA對(duì)消融面積的影響 （比例尺=0.5μm，*p＜0.05，**p＜0.01） Fig.7 Ablation area under different pulse widths after nsPEF treatment with or without GNR-PEG-FA (scale bar =0.5μm, *p＜0.05, **p＜0.01)

圖8 不同脈沖個(gè)數(shù)下nsPEF聯(lián)合或者不聯(lián)合GNR-PEG-FA對(duì)消融面積的影響 （比例尺=0.5μm，*p＜0.05，**p＜0.01） Fig.8 Ablation area under different pulse numbers after nsPEF treatment with or without GNR-PEG-FA (scale bar =0.5μm, *p＜0.05, **p＜0.01)

類似地，當(dāng)改變脈沖寬度（見圖7）或脈沖個(gè) 數(shù)（見圖8）時(shí)，也呈現(xiàn)出這樣的規(guī)律，在脈沖寬度為100ns或脈沖數(shù)為15的情況下，在nsPEF單獨(dú)作用組和GNR-PEG-FA組中均未觀察到明顯的消融區(qū)域（黑色區(qū)域是被電極刮除）。當(dāng)脈沖寬度增加到300ns和500ns時(shí)，GNR-PEG-FA組的消融面積上升到了300ns時(shí)的5.477mm2和500ns時(shí)的10.066mm2，明顯高于nsPEFs單獨(dú)作用組300ns時(shí)的3.751mm2和500ns時(shí)的7.159mm2（消融面積增幅比例達(dá)到31.6%～88.2%）。當(dāng)脈沖個(gè)數(shù)增加到100和260時(shí)，GNR-PEG-FA的消融面積上升到了100時(shí)的5.477mm2和260時(shí)的8.237mm2，明顯高于nsPEFs單獨(dú)作用組100時(shí)的3.751mm2和260時(shí)的7.074mm2（消融面積增幅比例達(dá)到45.8%～62.6%）。 由此可見，GNR-PEG-FA的加入能夠有效提高nsPEF消融腫瘤的效果。

3 討論

3.1 GNR-PEG-FA聯(lián)合nsPEF增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞消融面積的電學(xué)機(jī)制

具有高電導(dǎo)率的金納米棒具有獨(dú)特的棒狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)將金納米棒置于均勻電場(chǎng)中時(shí)，由于“避雷針效應(yīng)”[27]，可以增強(qiáng)金納米棒尖端局部的電場(chǎng)強(qiáng)度，其增強(qiáng)作用可以描述為

式中，Etip、E0分別為尖端電場(chǎng)強(qiáng)度和外加均勻電場(chǎng)強(qiáng)度；L和D分別為金納米棒的長(zhǎng)度和外徑；α為常數(shù)。

由于細(xì)胞膜在受到電場(chǎng)作用時(shí)，可將其假設(shè)為一個(gè)阻容模型，因此，當(dāng)對(duì)細(xì)胞施加電場(chǎng)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其跨膜電壓增加。當(dāng)跨膜電壓增加到臨界閾 值[28-30]時(shí)，細(xì)胞膜兩端會(huì)由于無法繼續(xù)承受更高的電壓，發(fā)生穿孔，即電穿孔。而可以引起電穿孔的電場(chǎng)強(qiáng)度描述[31]為

式中，?Δ為發(fā)生電穿孔所需的跨膜電壓閾值，通常為1V；d為球型細(xì)胞的直徑；θ為細(xì)胞膜某一位置與細(xì)胞中心法向方向與該位置受到電場(chǎng)E的方向之間的夾角。

式（2）表明，影響細(xì)胞膜某一點(diǎn)上跨膜電位的主要因素是電場(chǎng)強(qiáng)度的大小。由于避雷針效應(yīng)（見式（1）），GNR-PEG-FA可以局部地增強(qiáng)細(xì)胞周圍的電場(chǎng)強(qiáng)度，從而增強(qiáng)nsPEF對(duì)細(xì)胞的電穿孔作用。但是，由于金納米棒尺寸較小，其電場(chǎng)增強(qiáng)的范圍有限，所以為了更有效地利用金納米棒的避雷針效應(yīng)，本研究用FA修飾了金納米棒以靶向A375黑色素瘤細(xì)胞，以使更多的金納米棒聚集在細(xì)胞周圍，細(xì)胞承受的電場(chǎng)增強(qiáng)效果也越強(qiáng)，電穿孔效應(yīng)也越明顯，nsPEF的消融效果也得到增強(qiáng)。類似地，避雷針效應(yīng)還用于其他一些增強(qiáng)的電穿孔應(yīng)用中[32-35]，顯示出與本研究相似的結(jié)果。

3.2 GNR-PEG-FA聯(lián)合nsPEF對(duì)閾值電場(chǎng)強(qiáng)度的影響

電場(chǎng)強(qiáng)度的分布在圖4中示出，離電極越遠(yuǎn)，電場(chǎng)強(qiáng)度越小。由于難以確定脈沖處理過程中金納米棒的分布和數(shù)量，因此，如果想要通過仿真完全模擬存在GNR-PEG-FA時(shí)的空間電場(chǎng)分布是非常不準(zhǔn)確的。因此，本文以未加入GNR-PEG-FA時(shí)的空間電場(chǎng)分布為基準(zhǔn)，以此來判定加入或不加入GNR-PEG-FA時(shí)各個(gè)脈沖參數(shù)下對(duì)應(yīng)的閾值電場(chǎng)強(qiáng)度，這樣也更方便后續(xù)治療方法的確定。圖6b～圖8b均給出了將消融區(qū)域與電場(chǎng)合并的模擬結(jié)果。圖9給出了在不同脈沖參數(shù)下的電場(chǎng)強(qiáng)度閾值的差異（顯著性差異指兩實(shí)驗(yàn)組之間電場(chǎng)強(qiáng)度閾值的統(tǒng)計(jì)分析）。

當(dāng)施加的脈沖電壓為變量時(shí)，在任一脈沖電壓下，各組的閾值電場(chǎng)強(qiáng)度分別保持不變，而GNR- PEG-FA組的4.5kV/cm比nsPEF單獨(dú)作用組的5.5kV/cm降低了約18.2%。

當(dāng)脈沖個(gè)數(shù)為變量時(shí)，nsPEF單獨(dú)作用組的平均電場(chǎng)強(qiáng)度閾值從100時(shí)的5.5kV/cm降低到了260時(shí)的4.5kV/cm，而GNR-PEG-FA組的平均電場(chǎng)強(qiáng)度閾值從100時(shí)的4.5kV/cm降低到260時(shí)的3.5kV/cm。 與nsPEF單獨(dú)作用組相比，GNR-PEG-FA組閾值電場(chǎng)強(qiáng)度的降低幅度為100時(shí)的18.2%和260時(shí)的22.2%。

圖9 不同脈沖參數(shù)下的電場(chǎng)強(qiáng)度閾值 （*p＜0.05, **p＜0.01） Fig.9 Electric field threshold under different pause parameter (*p＜0.05, **p＜0.01)

當(dāng)脈沖寬度為變量時(shí)，nsPEF單獨(dú)作用組的平均電場(chǎng)強(qiáng)度閾值從300ns時(shí)的5.5kV/cm降低到500ns時(shí)的4kV/cm，而GNR-PEG-FA組的平均電場(chǎng)強(qiáng)度閾值從300ns時(shí)的4.5kV/cm降低到500ns時(shí)的3kV/cm。與nsPEF單獨(dú)作用組相比，GNR-PEG-FA組閾值電場(chǎng)強(qiáng)度的降低幅度為300ns時(shí)的18.2%和500ns時(shí)的25%。

總之，脈沖電壓的變化不會(huì)影響最終閾值電場(chǎng)強(qiáng)度的變化，但是由于脈沖電壓的提高，使得閾值電場(chǎng)強(qiáng)度的分布范圍擴(kuò)大了，從而實(shí)現(xiàn)了消融面積的增加。當(dāng)脈沖寬度和脈沖個(gè)數(shù)增加時(shí)，閾值電場(chǎng)強(qiáng)度呈現(xiàn)出明顯的降低趨勢(shì)。K. H. Schoenbach等研究了不同電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖個(gè)數(shù)和脈沖寬度下納秒脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響定律，文中將可觀察到的生物電效應(yīng)強(qiáng)度與脈沖參數(shù)之間的關(guān)系描 述[36]為

式中，S為可觀察到的生物電效應(yīng)的強(qiáng)度；E為電場(chǎng)強(qiáng)度；τ為脈沖寬度；N為脈沖數(shù)。

假定實(shí)現(xiàn)A375腫瘤細(xì)胞消融的強(qiáng)度S是恒定的。如式（3）所示，當(dāng)τ或N增加時(shí)，只需要較低的電場(chǎng)強(qiáng)度E就可以達(dá)到相同的S。這意味著在研究中，消融A375細(xì)胞的視野閾值降低了。然而，較高的施加電壓只能擴(kuò)大電場(chǎng)強(qiáng)度閾值的空間分布面積，這會(huì)增加消融面積，但不能影響電場(chǎng)強(qiáng)度閾值，所以導(dǎo)致電場(chǎng)強(qiáng)度閾值在不同電壓下應(yīng)相同，這與本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也十分吻合。這項(xiàng)研究的結(jié)果可以為未來的體內(nèi)研究或臨床應(yīng)用提供參考。通過合理選擇納秒脈沖參數(shù)，并聯(lián)合GNR-PEG-FA，可以有效地降低閾值電場(chǎng)強(qiáng)度，為黑素瘤治療提供一種更加安全有效的物理療法。

4 結(jié)論

本文首先通過暗場(chǎng)顯微鏡證明了葉酸修飾的金納米棒可以有效結(jié)合A375黑色素瘤細(xì)胞。在確定了靶向效果的前提下，首次研究了GNR-PEG-FA聯(lián)合nsPEF對(duì)A375黑色素瘤2D體外模擬組織消融情況的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脈沖參數(shù)強(qiáng)度（電壓、脈沖數(shù)和寬度）增加時(shí)，細(xì)胞的消融面積呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。但是，閾值電場(chǎng)強(qiáng)度不受脈沖電壓變化的影響，而與脈沖寬度和脈沖個(gè)數(shù)呈負(fù)相關(guān)。更重要的是，與單獨(dú)使用nsPEF相比，添加GNR-PEG- FA可以顯著增加消融面積并有效降低電場(chǎng)強(qiáng)度閾值。因此，在合適的脈沖參數(shù)指導(dǎo)下，nsPEF聯(lián)合GNR-PEG-FA有望成為一種安全有效的物理治療 方法。