p62蛋白在食管鱗癌細胞中核漿易位的機制研究

楊荔艷，劉奏，郝佳潔，張鈺，，王明榮，

(1.國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院檢驗科，北京100021；2.國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院，分子腫瘤學國家重點實驗室，北京100021)

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國高發且預后較差的惡性消化道腫瘤，其發病率位居我國惡性腫瘤的第3位，死亡率位居第4位，嚴重威脅我國人民的健康甚至生命。食管鱗癌患者死亡率高的原因，一方面在于食管鱗癌患者早期階段常無任何癥狀，且相當比例的患者在確診時已無法切除或已出現影像學可見的轉移灶，而發生轉移的晚期食管鱗癌患者未經藥物治療的中位生存時間小于6個月，使用一線化療藥物治療后的中位生存時間也僅為8~13.8個月。因此，研究發現食管鱗癌中特異的分子標志，建立有效的診斷方案，將有助于提高早期食管鱗癌患者的檢出率，從而降低其死亡率。

我們前期研究發現p62在食管鱗癌細胞的細胞漿中表達，而在正常食管細胞中定位于細胞核，即存在明顯的核漿易位，尤其是在約30%的T1N0M0期的食管鱗癌組織中可以觀察到p62在癌細胞漿中表達，表明p62的核漿易位在食管鱗癌發生發展過程中是一個早期事件，有可能作為食管鱗癌早期診斷的分子標志。進一步的功能研究表明，細胞漿表達的p62顯著增強食管鱗癌細胞的抗凋亡能力。

p62(sequestosome-1，SQSTM1)是一種多功能的泛素化結合接頭蛋白，包括PB1、ZZ、TB、LIR、KIR及UBA多個結構域，以及兩個核定位信號(nuclear localization signal，NLS)和一個核輸出信號(nuclear export signal，NES)。多項研究表明，在腫瘤發生發展過程中，腫瘤細胞的自噬水平下降，目前已在肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌和結腸癌等多種腫瘤中發現了p62的高表達。特別地，胞漿中p62的積累是預測前列腺癌患者不良預后的獨立因素，這與我們在食管鱗癌中的發現一致。

p62在食管鱗癌中發生核漿易位的分子機制目前尚無文獻報道，我們推測p62在食管鱗癌細胞中出現核漿易位也可能與核定位信號或者核輸出信號相關位點的磷酸化狀態相關。本研究基于前期研究結果和文獻報道，首先通過構建p62不同磷酸化突變體，并將其轉至KYSE30細胞和內源性敲降p62的KYSE150細胞中，研究p62磷酸化狀態與其核漿定位的關系；進一步通過Co-IP、PLA實驗，初步探索可能影響p62磷酸化的激酶。本研究結果將為深入了解p62在食管鱗癌細胞中核漿易位的分子機制提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

p62抗體購于MBL，GSK-3β抗體購于CST，GFP和GAPDH抗體均購于Proteintech。引物由北京天一輝遠公司合成，定點突變試劑盒KOD Plus Mutagenesis Kit購于TOYOBO公司。轉染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，Protein A/G磁珠購于MCE公司，鄰位連接實驗試劑盒購于Sigma公司。

主要儀器包括激光共聚焦顯微鏡(PerkinElmer)，電泳儀(BIO-RAD)，電轉儀(Tanon天能)，微板分光光度計(BioTek Instruments)。

1.2 細胞系及培養條件

食管鱗癌細胞系KYSE30、KYSE70、KYSE150和KYSE510由日本京都大學Shimada教授惠贈，用于包裝慢病毒的人胚腎細胞株HEK293FT由本實驗室保存，以上細胞均經過短串聯重復序列(short tandem repeat，STR)驗證。食管鱗癌細胞系使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，置于37℃、CO體積分數為5%的培養箱中培養。HEK293FT細胞使用含10%胎牛血清、1%L型谷氨酰胺、1%非必需氨基酸以及1%遺傳霉素G418的DMEM培養基進行培養。

1.3 免疫熒光實驗

選取前期報道的p62內源性高表達的食管癌細胞(KYSE150，KYSE510及KYSE70)，將細胞接種至玻片上，同時設置實驗組和對照組，細胞貼壁后，實驗組加入1 μmol/L核輸出抑制劑KPT330，對照組加入等體積的溶劑處理30 min。然后棄去原培養基并使用PBS清洗，經過4%多聚甲醛固定和5%BSA封閉后，使用p62一抗進行孵育，再用FITC標記的二抗進行免疫熒光染色，DAPI復染標記細胞核，利用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

1.4 磷酸化質譜鑒定

培養并收集足量的KYSE510細胞，加入SDT裂解液，超聲裂解細胞(超聲條件：80 W，工作10 s，間歇15 s，循環10次)；沸水浴15 min，14 000 r/min離心40 min，取上清，BCA法進行蛋白質定量，分裝樣品，-80℃保存，送中科新生命科技公司進行LC-MS/MS鑒定；取400 μg蛋白進行酶解，然后使用Anti-Anti-P-Tyr antibody beads富集磷酸化肽段；獲得的酶解產物使用Maxquant軟件(版本號1.3.0.5)對質譜數據進行查庫，分析質譜獲得的肽段所對應的蛋白以及磷酸化位點。

1.5 定點突變體構建

按照常規載體構建方法首先構建pEGFP-C1-p62蛋白全長真核表達載體，然后以此載體為基礎按照KOD Plus Mutagenesis Kit(TOYOBO)定點突變試劑盒說明書分別將p62蛋白的T269/S272/S328/S332位點突變成谷氨酸(Glu，E)使其處于持續磷酸化狀態，或突變為丙氨酸(Ala，A)使其保持去磷酸化狀態，構建出p62不同磷酸化狀態的真核表達載體。構建突變體的引物序列(5′-3′)如下：T269A上游GCACCCGTCTCTC CAGAGAGTTCCAGCA；T269E上游GAACCCGTCTCT CCAGAGAGTTCCAGCA；T269下 游CAGGCGGCTTC TTTTCCCTCCGTGC。S272A上 游GCACCAGAGAGTT CCAGCACAGAGGAGA；S272E上游GAACCAGAGAG TTCCAGCACAGAGGAGA；S272下 游GACGGGGGTC AGGCGGCTTCTTTTC。S328A上 游GCAGATAACTGT TCAGGAGGAGATGATG；S328E上 游GAAGATAACT GTTCAGGAGGAGATGATG；S328下游CTCCATCTGT TCCTCAGGGCGCCCC。S332A上 游GCAGGAGGAGAT GATGACTGGACCCATC；S332E上游5GAAGGAGGAGA TGATGACTGGACCCATC；S332下 游ACAGTTATCCG ACTCCATCTGTTCC。

1.6 慢病毒包裝及感染

按照常規載體構建方法首先將針對p62 UTR1序列的shRNA寡核苷酸構建至PLKO.1載體上，鑒定獲得PLKO.1-shp62質粒。shRNA寡核苷酸由天一輝遠公司合成，序列(5′-3′)如下：上游CCGGTGCCTAATGG CTTTCACTTTCCTCGAGGAAAGTGAAAGCCATTAGGC ATTTTT；下 游-AATTAAAAATGCCTAATGGCTTTCA CTTTCCTCGAGAAAGTGAAAGCCATTAGGCA。

將HEK293FT細胞接種于6 cm培養皿，置于37℃培養箱中培養16~18 h，使細胞匯合度達到70%；利用轉染試劑lipofectamine 2000將慢病毒的包裝質粒psPAX2、pMD2.G以及PLKO.1-shp62質粒按照3 μg：3 μg：6 μg的比例共同轉染至KEK293FT細胞中；轉染完成后，每隔24 h收集一次病毒上清，共收集兩次，然后使用0.22 μm濾膜將病毒上清過濾，分裝后置于-80℃保存備用。

將生長狀態良好的食管鱗癌細胞接種至6孔板中，細胞貼壁后匯合度約50%；然后棄去原培養基，更換為1 mL新鮮的完全培養基，加入0.5 mL病毒上清和8 μg/mL的polybrene進行感染；感染12 h后，棄去含病毒的培養基，更換為含嘌呤霉素的新鮮培養基，進行抗性篩選，獲得穩定敲降p62的食管鱗癌細胞。

1.7 免疫共沉淀實驗

收取足量的食管鱗癌細胞，使用非變性裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；取1 mg總蛋白平均分為兩份，一份加入p62抗體(購自于MBL)，另一份加入等量的與p62同一種屬來源的正常同型IgG(購自于CST)，4℃孵育過夜；然后加入50 μL proteinA/G磁珠(購自于MCE)，4℃孵育1 h，經磁性分離后獲得復合物；將沉淀用20 μL 3X SDS上樣緩沖液重懸，置于95~100℃金屬浴中加熱2~5 min，12 000 r/min離心1 min獲得蛋白上清以進行后續的Western blot實驗。

1.8 鄰位連接實驗

按照試劑盒說明書進行操作。細胞接種同免疫熒光實驗，然后細胞爬片依次經固定、封閉、一抗孵育、探針孵育、連接、擴增后固定于載玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

2 結果

2.1 p62是一個具有核漿穿梭功能的蛋白

免疫熒光實驗結果(圖1)顯示，食管鱗癌細胞經核輸出抑制劑KPT330處理30 min后，綠色熒光信號(p62)即轉移至細胞核，而對照組綠色熒光信號一直分布在細胞漿。說明食管鱗癌細胞在被核輸出抑制劑處理前后，p62蛋白存在由細胞漿到細胞核的易位。

圖1 利用核輸出抑制劑處理后，p62聚集在細胞核

2.2 p62蛋白的磷酸化狀態與其核漿定位相關

我們選取前期報道的p62內源性高表達的KYSE510細胞進行了磷酸化質譜分析，發現在KYSE510細胞系中p62蛋白存在T269/S272/S328/S332共4個位點的磷酸化(圖2)，其中T269/S272位于核定位信號(NLS2：261~272)內，S328/S332位于出核信號(NES：302~320)附近。

圖2 食管鱗癌細胞中存在T269/S272/S328/S332共4個位點的磷酸化

我們將不同位點磷酸化的質粒瞬時轉染至p62內源性低表達的KYSE30細胞中，培養48 h后，通過免疫熒光實驗結合激光共聚焦顯微鏡觀察，發現AAAA處理組(4個位點全部非磷酸化)信號定位在細胞漿，AAEE(269/272位點非磷酸化，328/332位點磷酸化)處理組定位在細胞漿，EEAA(269/272位點磷酸化，328/332位點非磷酸化)處理組定位在細胞核，EEEE處理組(4個位點全部磷酸化)定位在細胞漿(圖3A)。同時，為了排除內源性p62的影響，我們通過慢病毒包裝系統，篩選獲得穩定表達p62不同磷酸化狀態的細胞株。免疫熒光實驗結合激光共聚焦顯微鏡觀察，發現在內源性p62穩定敲降的細胞中p62的核漿定位情況與KYSE30細胞的結果一致(圖3B)。

圖3 T269/S272/S328/S332的磷酸化狀態影響p62蛋白的核漿定位

2.3 GSK-3β可能是影響p62磷酸化的激酶

我們分析發現，p62的S328/S332位點的序列S328-D-N-C-S332，與GSK-3β磷酸化底物基序S/TX-X-X-Sp匹配。因此，我們利用Co-IP實驗檢測了p62與GSK-3β的相互作用情況，結果顯示p62和GSK-3β存在同一復合物中(圖4A)。我們進一步通過鄰位連接技術分析了KYSE150細胞中p62與GSK-3β的相互作用方式，激光共聚焦顯微鏡觀察發現，使用p62與GSK-3β抗體共同孵育細胞后出現紅色的陽性信號，即產生了鄰近效應。以上結果說明，p62與GSK-3β存在直接的相互作用。

圖4 p62與GSK-3β存在直接的相互作用

3 討論

p62目前已被證實是一種致癌蛋白，其高表達在腫瘤細胞周期調控、增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程中發揮重要作用，具有腫瘤診斷、預后判斷、治療監測等價值。我們前期研究發現p62在食管鱗癌細胞中存在明顯的核漿易位現象，本研究基于前期基礎，探討了p62在食管鱗癌細胞中發生核漿易位的可能的調控方式。有研究發現p62蛋白在宮頸鱗癌HeLa細胞中可以穿梭于細胞漿和細胞核之間，且這種現象受到核定位信號或其附近位點磷酸化的調控。我們推測p62在食管鱗癌細胞中出現核漿易位也可能與核定位信號或者核輸出信號相關位點的磷酸化狀態相關。我們通過磷酸化質譜分析發現在食管鱗癌細胞中p62蛋白存在T269/S272/S328/S332等4個位點的磷酸化，其中T269/S272位于核定位信號(NLS2：261~272)內，S328/S332位于出核信號(NES：302~320)附近。通過構建這4個位點的磷酸化突變體，發現其磷酸化狀態與其出核和入核過程相關。特別地，T269/S272位點磷酸化、且同時S328/S332位點去磷酸化后，p62定位至細胞核中。說明在食管鱗癌細胞中，p62的磷酸化狀態確與其核漿定位相關，但是其磷酸化又受到何種分子的調控？從圖3結果看，S328/S332位點磷酸化對于p62的胞漿定位至關重要。關于S328/S332位點的磷酸化，迄今尚無研究報道，且無商售抗體。我們分析了p62蛋白發生磷酸化的序列，發現包含S328/S332位點的序列S328-D-N-C-S332，與GSK-3β的磷酸化底物基序S/T-X-X-X-Sp相互匹配。GSK-3β是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于GSK-3激酶中的一種亞型，可以磷酸化多種底物，影響增殖、代謝、DNA修復等多個生物學過程。在作用機制上，GSK-3β可以通過介導AMPK通路抑制自噬而促進乳腺癌細胞的遷移能力；通過激活Akt/GSK-3β/Nrf2通路，提高細胞的抗氧化應激能力；通過抑制細胞自噬，增強非小細胞肺癌的放療敏感性，因而是一個潛在的治療靶點。因此，我們首先利用Co-IP實驗證實p62與GSK-3β存在相互作用，進一步利用PLA實驗明確p62是否為直接的底物與GSK-3β相互結合。PLA技術是一種特殊的免疫分析方法，可將蛋白信號放大1 000倍，檢測兩個蛋白最大距離為30 nm，是驗證兩個分子直接相互作用的最有效手段，可作為兩個蛋白質之間相互作用的定性依據。本研究結果顯示，p62與GSK-3β蛋白存在鄰近效應，即二者為直接的相互作用，據此我們推測GSK-3β有可能是調控p62蛋白S328/S332位點磷酸化的潛在激酶。

綜上所述，本研究在食管鱗癌細胞中發現p62蛋白S328/S332位點磷酸化狀態影響其核漿定位，且可能是由激酶GSK-3β調控的，這些發現對于深入認識p62在食管鱗癌中的作用具有重要意義。