以樹鼩為微核試驗新型動物模型的初步研究

蔡綺，高德煜，史建峰，于浩，韓妍，楊柳，趙蕾，王召旭，

(1.云南省醫療器械檢驗研究院，云南昆明650106；2.中國食品藥品檢定研究院，北京100050；3.煙臺大學，山東煙臺264005)

樹鼩作為一種新型靈長類試驗動物，正逐步引起國內外科學家們的關注。樹鼩是一種類似松鼠的小型哺乳動物，屬于攀鼩目樹鼩科，廣泛分布于東南亞的熱帶、亞熱帶地區，我國主要分布在貴州、云南等省份。攀鼩目共2科5屬，分為晝行性樹鼩科和夜行性筆尾樹鼩科。我國的唯一代表樹鼩種類是樹鼩屬中的北樹鼩，又叫中緬樹鼩，而北樹鼩中的滇西亞種是目前全世界研究最廣泛的一種樹鼩類型。相比于嚙齒類，樹鼩在進化分類、基因組解析上更接近靈長類，而相比于與人類更相似的非人類靈長類動物，具有體型小、易飼養、成本低、繁殖時間短等優點。研究表明，樹鼩具有與人相似的代謝過程，在代謝性疾病、神經疾病、腫瘤等疾病中具有明顯的優勢，在模擬人類疾病模型方面較嚙齒類與人類親緣性更揚近，樹鼩內分泌器官的總體結構特點與靈長類更近似。樹鼩的全基因組測序表明樹鼩有93.4%與靈長動物相似，并且通過建立系統發育樹、估算分歧時間，均支持樹鼩與靈長類的親緣關系更近。樹鼩的晝夜節律與人類更接近及對壓力的敏感性均提示樹鼩能更好的模擬人類的心理疾病；并且視覺系統與人類更近似，是進行視覺系統疾病研究的理想模型。近年來樹鼩的基因組數據庫在不斷地豐富，在醫學生物學研究中許多人類病毒感染的樹鼩模型成功建立，均顯示樹鼩未來廣闊的應用前景。最近轉基因技術的成功應用，為樹鼩模型的未來發展提供了廣闊的空間。

遺傳物質改變引起DNA損傷的固定，被認為具有可遺傳性，并且是惡性腫瘤發展的環節之一。遺傳毒性試驗主要是通過一系列體內體外試驗來檢測樣品是否會引起基因突變、染色體結構畸變等遺傳物質變化的試驗。根據檢測的遺傳學終點將遺傳毒性試驗分為檢測基因突變、染色體畸變、染色體組畸變、DNA原始損傷4種類型。檢測染色體畸變的體內微核試驗(OECD474)中微核的形成是細胞受遺傳毒物影響的遺傳學終點。微核試驗是一種可以快速檢測導致染色體損傷和干擾細胞有絲分裂的遺傳毒物的檢測方法，根據骨髓細胞中染色體斷裂形成微核的數量來鑒定某物質遺傳毒性大小。

目前，國內外樹鼩的研究主要集中于疾病模型的建立，在醫療器械生物學評價領域中樹鼩還未得到應用。因為樹鼩與人類親緣性較近，兼具體積小、繁殖時間短、易于實驗操作等優勢，應用前景廣闊。本研究以樹鼩為動物模型，建立微核試驗體系，將樹鼩作為新型模式動物應用于醫療器械生物相容性評價進行初探。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物選擇

樹鼩來自中國科學院動物研究所，選擇健康、未產、未孕、未進行過試驗的樹鼩30只，雌雄各半，體質量120~150 g，試驗前7 d適應環境。小鼠30只來自中國食品藥品檢定研究院試驗動物資源研究所(SPF級)，雌雄各半，體質量18~20 g，6~8周齡，試驗前3 d適應環境。

1.1.2 樣品和試劑

樣品為膠原蛋白植入劑，由山西錦波生物醫藥股份公司生產，批號20180101，型號III型。陽性對照品為環磷酰胺，購自阿拉丁。陰性對照品為氯化鈉，購自昆明南疆制藥有限公司。胎牛血清，購自天航生物科技有限公司；氯胺酮，購自江蘇中牧倍康藥業有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 微核試驗

將樹鼩和小鼠按照體質量隨機分為3個組，分別是陰性對照組、樣品組和陽性對照組，每組10只，雌雄各半。樹鼩適應環境7 d后，當天稱量體質量，計算給藥量進行腹腔注射給藥。陰性對照組給予生理鹽水，樣品組給予膠原蛋白Ⅲ原液，劑量為10 mL/kg，陽性對照組給予環磷酰胺，劑量為40 mg/kg。選擇30 h兩次給藥法，第1次給藥24 h后進行第2次給藥，給藥6 h后腹腔注射氯胺酮麻醉，腹腔主靜脈取血并放血處死樹鼩后立即解剖。股骨用75%乙醇浸泡過的紗布剔除殘余肌肉，剪斷肌骨。在載玻片上滴加10~20 μL胎牛血清，用止血鉗擠壓股骨使骨髓與血清混合，制備骨髓涂片，對樹鼩骨髓紅細胞微核進行觀察和計數。自然晾干后，用甲醇固定10 min，然后進行Gimesa染色，每只樹鼩在油鏡下計數1 000個嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocytes，PCE)中的微核細胞數(micronuclei，MN)，并計數200個紅細胞中PCE與正染紅細胞(normochromatic erythrocyte，NCE)的比值，使用Leica CTR6500顯微鏡配合圖像分析系統進行圖片采集。

小鼠陰性對照、樣品注射劑量為50 mL/kg，每只小鼠注射1 mL。陽性對照組劑量為40 mg/kg。第1次給藥24 h后進行第2次給藥，第2次給藥6 h后測量體質量，取血后脫頸椎致死。取股骨制備骨髓涂片，對小鼠骨髓紅細胞微核進行觀察和計數，步驟同樹鼩。

1.2.2 組織病理學檢測

樹鼩注射氯胺酮麻醉后，腹腔主靜脈取血并放血，處死后立即解剖，剝離組織取肝、脾、腎，測量臟器濕質量并立即放入10%中性甲醛固定液中固定。1周后將臟器取出做石蠟切片及蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色并通過普通光學顯微鏡觀察各器官組織的病理學特征，記錄病變程度。所采血液進行血常規、血生化和電解質檢測。小鼠在第2次給藥6 h后測量體質量，取血后脫頸椎致死。取肝、脾、腎，固定、切片及染色，進行組織病理學檢測。

1.3 統計學方法

將樣品組和陽性對照組的微核率、PCE/NCE比值和臟器系數，分別與陰性對照組進行比較，采用雙側

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檢驗進行統計分析。

2 結果

2.1 小鼠和樹鼩微核試驗結果

在小鼠微核試驗參考體系中，陽性對照組細胞的微核率顯著高于陰性對照組，樣品組微核率與陰性對照組差異無統計學意義，根據哺乳動物紅細胞微核試驗標準(OECD474 Mammalian Erythocyte Micronucleus Test)要求，該試驗系統成立。供試樣品組小鼠微核率與陰性對照組差異無統計學意義(表1)，試驗結果為陰性。在樹鼩的微核試驗體系中，參考小鼠模型，試驗系統成立(表2)，供試樣品組微核試驗結果為陰性，得到與小鼠微核試驗一致的結果。

表1 小鼠微核試驗結果

表2 樹鼩微核試驗結果

小鼠微核試驗中，供試樣品組PCE/NCE的比值未低于陰性對照組的20%；陰性對照組、供試樣品組的微核率<5‰，供試樣品組與陰性對照組間的差異無統計學意義(

P

>0.05)；而陽性對照組與陰性對照組間的差異顯著(

P

<0.01)。雌性小鼠和雄性小鼠微核試驗PCE/NCE比值和微核率差異無統計學意義。

圖1 微核試驗骨髓細胞涂片

參考小鼠微核試驗體系，樹鼩的微核試驗中，供試樣品組PCE/NCE的比值未低于陰性對照組的20%；陰性對照組、供試樣品組的微核率<5‰，供試樣品組與陰性對照組間的差異無統計學意義(

P

>0.05)；陽性對照組與陰性對照組間的差異極顯著(

P

<0.01)，雌性樹鼩和雄性樹鼩微核試驗PCE/NCE比值和微核率差異無統計學意義。

2.2 小鼠和樹鼩血常規、血生化和電解質檢測結果

該試驗通過血常規、血生化和電解質檢測，與組織病理學、臟器系數一起分析供試樣品的毒性及試驗體系的可行性。由于小鼠血量較少，只進行血常規檢測。

小鼠的血常規檢測結果顯示，與陰性對照組相比，樣品和陽性對照組的白細胞、紅細胞、平均血小板體積等血常規生理指標差異無統計學意義(

P

>0.05)；樹鼩的血常規檢測結果顯示，陽性對照組淋巴細胞數量和百分比差異有統計學意義(

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<0.05)；樹鼩的血生化指標檢測結果顯示，與陰性對照組相比，樣品組雌性樹鼩的谷氨酰轉肽酶差異有統計學意義(

P

<0.05)；樹鼩電解質檢測結果顯示，與陰性對照組相比，樣品組的電解質指標差異無統計學意義(

P

>0.05)，陽性對照組鈣離子的濃度差異有統計學意義(

P

<0.05)。

2.3 小鼠和樹鼩臟器系數

與陰性對照組比較，小鼠的臟器系數結果中，供試樣品結果為陰性，陽性對照組脾系數差異極顯著(

P

<0.01)，見表3。樹鼩的臟器系數與陰性對照組相比，樣品組雄性的腎系數差異有統計學意義(

P

<0.05)，陽性對照組的脾系數差異有統計學意義(

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<0.05)，見表4。

表3 小鼠臟器系數

表4 樹鼩臟器系數

2.4 小鼠和樹鼩的肝、脾、腎組織病理學檢測

觀察小鼠組織病理學切片(圖2)，發現與陰性對照組相比，樣品組和陽性對照組的肝、脾、腎均無顯著病理學改變，脾淋巴濾泡和腎小球、腎小管均未見異常。觀察樹鼩組織病理學切片，結果顯示陰性對照組、樣品組與陽性對照組3組臟器均無顯著病理學改變，脾和腎內部結構也均無異常。

圖2 小鼠和樹鼩臟器組織病理學切片觀察結果

3 討論

本研究參考小鼠微核試驗方法，建立了以樹鼩為實驗動物的醫療器械生物學評價模型。在樹鼩微核試驗中，陽性對照組的骨髓紅細胞微核率顯著高于陰性對照組，該試驗體系成立。樹鼩微核試驗供試品的檢驗結果與小鼠的檢驗結果一致，綜合上述結果，證明樹鼩可以作為模式動物進行微核試驗評價。

在微核試驗中，PCE/NCE的比值是表征供試品細胞毒性的重要指標，在評價遺傳毒性前，應首先排除細胞毒性的影響。在本研究中，樹鼩的PCE/NCE的比值雖然在可接受范圍內，但是數值與小鼠差異明顯，推測原因可能是由于動物種屬差異和發育階段不同。另外，根據研究報道，按體質量/體表面積折算等效劑量系數，20 g小鼠與130 g樹鼩的等效劑量系數為0.636，在試驗中兩種動物采用的環磷酰胺劑量體積相同，造成樹鼩相對給藥量更高，也可能導致PCE/NCE的比值不同，需要更深入的研究和大量的試驗樣本數值積累，為樹鼩的PCE/NCE可接受范圍提供數據參考。在微核試驗中，環磷酰胺是一種常用的陽性劑，在本研究中，兩種動物的陽性對照組微核率均顯著升高，樹鼩不同性別的微核率差異更小。本研究旨在建立新模式動物的試驗體系，由于兩種動物在遺傳背景、微生物控制及飼養條件等方面存在較大差異，我們并未對兩種動物的反應敏感性進行比較。

環磷酰胺作為免疫抑制劑對血液系統、肝、電解質代謝等具有毒副作用，樹鼩部分指標變化明顯。由于樹鼩的藥物注射劑量更多，導致樹鼩脾的臟器系數和血液、電解質部分指標變化比小鼠明顯。環磷酰胺會改變脾組織結構，抑制淋巴細胞增殖；導致肝組織結構損傷和急性腎損傷。因此我們對外周免疫器官脾，環磷酰胺的主要蓄積器官肝和腎進行組織病理學觀察，但是未發現有病理意義的結果。環磷酰胺對脾等免疫器官有明顯的抑制作用，并且由于其自身毒性會導致機體肝、腎出現水腫，與該試驗結果兩個動物模型的臟器系數脾下降，而肝和腎升高一致。樹鼩陰性樣品發現雄性脾的臟器系數略高于雌性，雌性肝、腎系數略高于雄性，與相關研究結果一致。結合樹鼩的微核實驗結果，雄性比雌性變化大，推測雄性樹鼩比雌性更敏感，該猜測需要進一步驗證。此外，我們發現相比于小鼠的臟器系數，樹鼩的臟器系數與人類更接近。以中國男性的臟器系數(脾0.28%、肝2.35%、腎0.48%)為例，陰性對照組樹鼩臟器系數(脾0.14%、肝3.28%、腎0.81%)對比陰性對照組小鼠的臟器系數(脾0.48%、肝5.14%、腎1.02%)更加接近于人類。

本研究將樹鼩作為動物模型，進行了醫療器械生物相容性評價的首次探索。在本試驗體系下，相較于小鼠，樹鼩需要單籠單只飼養，動物飼養成本更高，樹鼩在動物質量控制相關條件和標準方面與小鼠仍具有很大差距，但是樹鼩的應用潛力已經引起越來越多的關注，相關質量控制方法和標準正在研究和制定，樹鼩在動物模型中的缺點在逐步解決。未來，樹鼩在試驗動物領域將得到更加廣泛的應用。

(感謝中國科學院昆明動物研究所靈長類研究中心和中國科學院昆明動物研究所藥物安全評價中心各位老師對本研究工作的協助)