三種梅毒螺旋體特異性抗體檢測方法性能評價

王娟梅 方孝美 宋 冰

海鹽縣人民醫院檢驗科，浙江嘉興，314300

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponemapallidum, TP)感染引起的以性接觸傳播為主的傳染病，也可通過血液傳播和母嬰傳播[1]。孕婦一旦感染,可導致胎兒早產、死產或娩出先天梅毒患兒。目前對于梅毒的實驗室檢測包括梅毒螺旋體檢查和血清學檢查，后者包括電化學發光免疫分析(ECLIA)、化學發光免疫分析(CLIA)、酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA)、免疫印跡實驗(TP-WB)等。TPPA使用TP減毒株制備抗原，與血清中抗體產生凝集反應，具有較高的靈敏度、特異性，美國疾病預防控制中心推薦TPPA作為確診方法[2]。ECLIA、CLIA、ELISA等檢測方法具有較高的靈敏度，但均有一定假陽性，臨床檢測常出現幾種方法結果不一致情況[3]。以往研究大多采用化學發光或ELISA篩查陽性后，再用TPPA確診[4]，此方式無法真實判斷試劑檢測的靈敏度和特異性，本研究采用TPPA確診標本來進行三種方法學的比較，具體研究如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 分析我院2020年6月至2020年12月間經TPPA確診的梅毒特異性抗體陽性標本60例，陰性標本60例，其中男71例，女49例，年齡18～86歲，并收集患者是否有痛風、心腦血管、腫瘤、糖尿病、類風濕關節炎等基礎疾病。

1.2 儀器與試劑 ECLIA由羅氏電化學發光分析儀(Cobas e602)及其配套試劑檢測完成(批號：51677002)，CLIA由萬泰生物Caris200及其配套試劑檢測完成(批號：20200626)。TPPA檢測試劑盒由日本富士瑞必歐株式會社生產(批號：20200603)，ELISA檢測試劑盒由萬泰生物生產(批號：N20200216)。

1.3 方法 實驗前將-20℃冷凍保存血清標本取出后復融，以TPPA檢測結果作為金標準，篩選TPPA陽性標本60例，陰性標本60例，分別通過ECLIA、CLIA、ELISA三種方法對標本同時進行檢測，并嚴格設立陰性、陽性對照。ECLIA、CLIA從測試到結果完成均由儀器自動完成，根據試劑盒說明書，將S/CO≥1樣本判斷為陽性，S/CO<1則判斷為陰性。ELISA的檢測采用雙抗原夾心法，按照試劑盒說明書，采用手工方法操作后酶標儀讀取OD值。TPPA的檢測采用手工操作，按照試劑說明書肉眼判讀結果，反應孔中光滑紐扣樣為陰性，出現凝集和不規則沉淀為陽性。比較三種方法不同S/CO區段TPPA檢測結果，確定不同檢測方法的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值、符合率、Kappa值等。分析不同方法學間S/CO相關性，并建立一元回歸方程，通過受試者工作曲線(ROC)判斷不同方法學對梅毒的診斷價值，并確定S/CO最佳截斷值，比較不同方法學AUC面積，了解與金標準檢測結果不符樣本的臨床特征。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件建立數據庫，兩種方法檢測結果差異分析采用配對卡方檢驗，兩連續變量相關性分析采用Pearson相關性分析，通過ROC曲線比較不同方法學對梅毒的診斷效果，根據Youden指數最大時S/CO值作為最佳截斷值，采用Medcalc軟件進行AUC比較，研究采用z檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同方法學檢測結果與TPPA檢測結果差異比較 ECLIA、CMI法S/CO<1時，所有標本TPPA檢測均為陰性，ELISA法S/CO<1時，其中2例樣本TPPA檢測為陽性。ECLIA法S/CO≥5時，TPPA檢測陽性率為100.00%，CLIA法S/CO≥7時，TPPA檢測陽性率為100.00%，ELISA法S/CO≥7時，TPPA檢測陽性率為100.00%，見表1。

表1 不同方法學檢測結果與TPPA檢測結果 例(%)

2.2 不同檢測方法S/CO相關性分析 ECLIA、CLIA法S/CO呈正相關，兩者間函數為y=1.1131x-0.0339(R2=0.877)。ELISA、ECLIA法S/CO呈正相關，兩者間函數為y=0.4907x+1.1931(R2=0.531)。ELISA、CLIA法S/CO呈正相關，兩者間函數為y=0.5978x+1.008(R2=0.558)，均P<0.05。ECLIA、CLIA法S/CO R2值均明顯高于ELISA與ECLIA法、ELISA與CLIA法(圖1～3)。

圖1 ECLIA、CLIA法S/CO散點圖 圖2 ELISA、ECLIA法S/CO散點圖 圖3 ELISA、CLIA法S/CO散點圖

2.3 不同檢測方法性能比較 ECLIA檢測梅毒特異性抗體靈敏度為100.00%，特異性為93.33%，陽性預測值為93.75%，陰性預測值為100.00%，符合率為96.67%，Kappa值為0.933，ECLIA、TPPA兩種方法檢測結果差異無統計學意義(P=0.125)。CLIA檢測梅毒特異性抗體靈敏度為100.00%，特異性為91.67%，陽性預測值為92.31%，陰性預測值為100.00%，符合率為95.83%，Kappa值為0.917，CLIA、TPPA兩種方法檢測結果差異無統計學意義(P=0.062)。ELISA檢測梅毒特異性抗體靈敏度為96.67%，特異性為86.67%，陽性預測值為87.88%，陰性預測值為96.30%，符合率為91.67%，Kappa值為0.833，ELISA、TPPA兩種方法檢測結果差異無統計學意義(P=0.109)，見表2。

表2 三種檢測方法性能比較 例

2.4 三種檢測方法ROC曲線分析 ECLIA檢測梅毒特異性抗體AUC為0.964(0.926～0.999)，S/CO截斷值1.90時，Youden指數最高。CLIA檢測梅毒特異性抗體AUC為0.946(0.903～0.989)，S/CO截斷值2.20時，Youden指數最高。ELISA檢測梅毒特異性抗體AUC為0.898(0.836～0.959)，S/CO截斷值2.30時，Youden指數最高，見圖4、表3。

表3 最佳截斷值時不同方法檢測性能

圖4 三種檢測方法ROC曲線分析

2.5 三種檢測方法曲線下面積比較 使用Medcalc軟件對3種方法學進行AUC比較，結果顯示，ECLIA、CLIA法診斷梅毒的AUC面積均大于ELISA法，差異具有統計學意義(均P<0.05)，CLIA、ECLIA診斷梅毒的AUC差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 三種方法學AUC面積比較

2.6 假陽性、假陰性樣本臨床特征 ECLIA、CLIA、ELISA法分別有4例、5例、8例檢測結果為假陽性，其中3例標本三種方法檢測均為假陽性。所有假陽性樣本中有基礎疾病占比高于無基礎疾病，年齡≥50歲占比高于<50歲，見表5。ECLIA、CLIA檢測樣本均無假陰性樣本，ELISA法假陰性樣本2例，均為男性，其中一例為再生障礙性貧血，另一例為一期梅毒。

表5 三種方法學檢測假陽性標本臨床特征分析

3 討論

以往研究表明，梅毒螺旋體免疫印跡試驗(TP-WB)診斷靈敏度、特異性均較高，早期潛伏期梅毒、Ⅱ期梅毒、神經梅毒的陽性診斷率達100%[5]，是梅毒診斷的“金標準”，但由于其操作復雜，影響因素眾多，臨床開展較少，故本次實驗采用TPPA作為梅毒特異性抗體檢測的金標準。Park[2]等對不同臨床分期的梅毒患者分別采用5種檢測方法進行梅毒特異性抗體檢測，證實除熒光螺旋體抗體吸收實驗(FTA-ABS)外，其余4種檢測方法敏感性均高于95.00%，FTA-ABS敏感性顯著低于TPPA。Ji[6]采用多中心研究比較CLIA、ELISA法檢測梅毒特異性抗體差異，認為CLIA特異性較高，萬泰ELISA檢測試劑盒敏感性最高。但暫未發現不同方法學S/CO相關性和檢測梅毒特異性抗體最佳截斷值的相關報道。

賀鋒等[7]研究認為雅培化學發光磁微粒免疫分析(CMIA)法S/CO>6.01或科美CLIA法S/CO>9.01時，陽性預測值均為100.00%。本研究發現，隨著S/CO增加，三種方法檢測的真陽性率逐漸增加，當ECLIA法S/CO≥5或CLIA法S/CO≥7或ELISA法S/CO≥7時，不同方法學檢測的樣本均為真陽性。通過相關性分析發現，ECLIA法、CLIA法S/CO R2值均明顯高于ELISA與ECLIA法、ELISA與CLIA法，結果產生的原因可能與ECLIA、CLIA法均為自動化儀器，批間檢測變異度較小，而本研究ELISA為手工法，不同檢測批次間變異度偏大有關。在梅毒篩查實驗中，診斷試劑特異性偏低可導致假陽性結果，可能會由于錯誤的梅毒診斷而給患者帶來精神負擔。而診斷試劑靈敏度偏低則可導致假陰性結果，造成一定程度的漏診，影響患者的早期診斷和早期治療[2]。Chen等[8]比較了兩種化學發光儀器檢測梅毒螺旋體特異性抗體效能，發現兩種化學發光檢測方法均存在一定程度的漏診和誤診。Xia等[9]研究發現，羅氏ECLIA、雅培CMIA、邁瑞CLIA檢測梅毒特異性抗體敏感度均為100.00%，與本研究相符。本研究亦發現三種方法與TPPA檢測結果均為高度一致，ECLIA法、CLIA法、ELISA法Kappa值分別為0.933、0.917、0.833，ECLIA法、CLIA檢測靈敏度較高，所有TP樣本均成功檢出，ELISA法有2例樣本漏檢，患者均為男性，其中一例為再生障礙性貧血，另一例為一期梅毒。再生障礙性貧血患者存在一定程度的體液免疫抑制和細胞免疫亢進，加上臨床常采用免疫抑制的治療手段，導致ELISA檢測假陰性。三種檢測方法均存在一定的假陽性，后續通過病歷資料的調查發現，此類患者大部分有基礎性疾病，如痛風、惡性腫瘤等。王欣俞等[10]研究認為可能與患者血清中一些干擾因素，如類風濕因子、異嗜性抗體、補體、自身抗體等有關。高楠等[11]通過ROC曲線分析比較了8種ELISA試劑檢測梅毒特異性抗體的差異，發現所有試劑S/CO最佳截斷值均高于廠家推薦值，更高于實驗室設定工作S/CO值。本研究亦證實，ECLIA、CLIA、ELISA最佳S/CO截斷值分別為1.90、2.20、2.30，均高于廠商推薦值，可能因廠商通過降低S/CO值提高試劑檢測的靈敏度，減少漏檢。ECLIA法、CLIA法診斷梅毒的AUC均大于ELISA法，說明其診斷效能高于ELISA法。在梅毒臨床診斷中，可以優化檢測流程，對于ECLIA法S/CO≥5或CLIA法S/CO≥7或ELISA法S/CO≥7標本無需進一步進行TPPA的檢測，以節約醫療資源，對于ECLIA法S/CO<5或CLIA法S/CO<7或ELISA法S/CO<7標本必須經TPPA復檢，結合臨床疾病特征后予以確診。本研究納入樣本數偏少，可能導致統計結果出現偏差，ROC曲線分析時折點明顯，另本研究中ELISA法均為手工操作，可能會導致不同檢測批次間對照孔OD值出現一定波動。

綜上所述，三種梅毒特異性抗體檢測方法均有較高的靈敏度和特異性，與TPPA檢測結果具有高度一致性，ECLIA、CLIA法診斷效能高于ELISA法。所有的檢測方法都具有其特殊的應用范圍，只運用單一的試劑診斷有很大的局限性，存在一定誤診和漏診。臨床工作中，梅毒的診斷需綜合血清學、病史、臨床表現等加以判斷，盡可能減少誤診、漏診。