基于UPLC-Q-TOF/MS的自發性高血壓大鼠血漿代謝組學研究

陳 帥，陸登成，王 維，韋姍姍

原發性高血壓(essential hypertension，EH)是常見的慢性疾病之一，是多種心腦血管疾病的獨立危險因素。EH發病涉及多個環節，但由于其受多基因、多因素影響，遺傳和環境因素通過什么途徑和環節升高血壓，至今尚無確切定論，治療效果也不盡如人意。

近年來，隨著系統生物學的不斷完善，對高血壓的研究角度逐漸由局部轉向整體。代謝組學通過對生物體體液或組織中的代謝物(分子量<1 000)進行檢測、確定、定量和分類，并將代謝物與生物過程關聯起來。磁共振(NMR)、液相色譜-質譜聯用(LC-MS)、氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)等技術是目前應用于代謝組學領域的主流手段。NMR無須前處理，對樣本沒有損傷，但靈敏度較低[1]。GC-MS具有高精密度、高靈敏度、高耐用性的特點，但對于生物體系中極性比較大的糖類、氨基酸等成分的分析，需要進行衍生化處理才能得到較多的代謝組分信息[2]。LC-MS具有對復雜生物樣本的分離能力以及更好的靈敏度，其中超高效液相色譜-串聯四極桿/飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF/MS)以其高分離度、高靈敏度、對難揮發或熱穩定性差代謝物的高分辨率，在分析機體復雜的代謝物中有極大優勢。

自發性高血壓大鼠(SHR)是目前全球公認最近似于人類EH的動物模型，其血壓一般在12周齡達到穩定，8周齡時屬血壓升高早期。本實驗通過UPLC-Q-TOF/MS技術檢測早期SHR和Wistar大鼠血漿差異性代謝物，并尋找潛在生物標志物，以期為高血壓發病早期的病理過程提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8只無特定病原體(SPF)級SHR，雄性，8周齡，體質量160～180 g；8只SPF級Wistar大鼠，雄性，8周齡，體質量250～280 g，均來源于北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物合格證：SCXK(京)2016-0006]。動物飼養光暗周期為12 h/12 h，自由飲食進水。所有實驗操作符合實驗動物管理條例。

1.1.2 試劑與儀器 儀器與耗材：Triple TOF 6600質譜儀(ABSCIEX，美國)；Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(Agilent，美國)；低溫高速離心機(Eppendorf5430R，德國)；色譜柱： A CQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column(Waters，美國)；ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm， 2.1×100 mm column(Waters，美國)；Softron智能無創血壓計BP-2010E(北京軟隆生物技術有限公司，中國)。

試劑：乙腈(Merck，1499230-935)；乙酸銨(Sigma，70221)；肝素(BioFroxx，EZ2811F323)等。

1.2 方法

1.2.1 血壓檢測 適應性飼養3 d后，每日09：00～11：00完成對SHR和Wistar血壓的測量，實驗期間共監測6次安靜狀態下大鼠血壓。測量前開啟預熱泵，溫度設定為37 ℃，預熱10 min后將大鼠放置于固定器中，把無創血壓測量尾套放置于大鼠尾部近根部，以未接觸尾部白毛為準，測量大鼠安靜狀態下尾壓，連續測量3次取平均值。

1.2.2 血漿收集及樣品處理 實驗結束后以戊巴比妥鈉麻醉心臟取血，將血液放入置有20 μL肝素(10 mg/mL)的1.5 mL離心管中抗凝。離心后收集血漿，用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存。檢測時取出樣本，在4 ℃環境下緩慢解凍后，加入400 μL預冷甲醇/乙腈/水溶液(2∶2∶1，V/V)混合，低溫超聲30 min，-20 ℃靜置10 min，14 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液真空干燥，質譜分析時加入100 μL乙腈水溶液(乙腈∶水=1∶1，V/V)復溶，渦旋，14 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液進樣分析。

1.2.3 UPLC-Q-TOF/MS分析條件 樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統HILIC色譜柱進行分離，柱溫25 ℃，流速0.3 mL/min，流動相組成A：水+25 mmol乙酸銨+25 mmol氨水，B：乙腈；梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，95%B；0.5～7.0 min，B從95%線性變化至65%；7.0～8.0 min，B從65%線性變化至40%；8.0～9.0 min，B維持在40%；9.0～9.1 min，B從40%線性變化至95%；9.1～12.0 min，B維持在95%。整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中。為避免儀器檢測信號波動而造成的影響，采用隨機順序進行樣本的連續分析。樣本隊列中插入QC樣品，用于監測和評價系統的穩定性及實驗數據的可靠性。

質譜條件：在正負模式下均使用電噴霧電離(ESI)。ESI源條件設置為：干燥氣溫度250 ℃，流量16 L/min；鞘氣溫度400 ℃，流速12 L/min；霧化器壓20 psig；毛細管電壓3 000 V；錐孔電壓0 V；裂解電壓175 V；采集頻率4 Hz；掃描范圍50～1 200；循環時間250 ms。在自動MS/MS采集中設置ESI源條件：霧化氣40，輔助氣80，氣簾氣30；源溫度650 ℃；源噴霧電壓±5 500 V。在高靈敏度模型下對二級離子掃描進行信息依賴采集(IDA)。參數設置：去簇電壓±60 V，碰撞能(35±15)eV，排除4 Da以內的同位素，每個循環監測10個離子。數據采集按質量范圍進行分段，50～300、290～600、590～900、890～1 200，從而擴大二級質譜的采集率，每個方法每段采取4個重復。所采得數據分別使用自建MetDDA和LipDDA，進行代謝物的鑒定。

2 結 果

2.1 血壓水平 SHR組收縮壓(160～180 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)、舒張壓(120～140 mmHg)及平均壓(130～150 mmHg)均高于Wistar組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1～圖3。

2.2 代謝組學分析 血漿樣本正離子模式PCA圖(見圖4)與血漿樣本負離子模式PCA圖(見圖5)，兩種模式下都能較好區分兩組大鼠。

圖4 PCA得分散點圖(正離子模式)

圖5 PCA得分散點圖(負離子模式)

為了更好地驗證兩組大鼠血漿樣本分離情況，對SHR組和Wisar組數據進行OPLS-DA分析(見圖6、圖7)。在OLPS-DA分析中兩組大鼠血漿樣本分離程趨勢更加明顯，正離子模式R2X=0.947，R2Y=0.999，Q2=0.777，負離子模式R2X=0.78，R2Y=0.998，Q2=0.879，證明該模型可靠。

圖6 OPLS-DA得分散點圖(正離子模式)

圖7 OPLS-DA得分散點圖(負離子模式)

在OPLS-DA模型分析中獲得SHR和Wistar大鼠S-Plot載荷圖(見圖8、圖9)。載荷圖中每一個位點代表一個變量，為造成SHR和Wistar大鼠差異的內在分子。變量的重要程度由VIP值決定，離中心越遠的位點其VIP值越大，根據VIP值的大小篩選出差異性變量，VIP值大于1的變量可能為潛在生物標記物。

圖8 S-Plot載荷圖(正離子模式)

圖9 S-Plot載荷圖(負離子模式)

2.3 差異性代謝物的鑒定 血漿樣本中共鑒定出差異性代謝物13種。詳見表1。

表1 SHR與Wistar大鼠血漿樣本中差異性代謝物情況

2.4 潛在代謝通路分析 利用Metabo Analyst數據庫及KEGG數據庫進行處理分析，選取P<0.05的代謝通路，其中涉及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝、初級膽汁酸的生物合成、組氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝這4種代謝途徑。各途徑及其相關差異性代謝物見表2，差異性代謝物及相關代謝通路見圖10。

表2 各代謝途徑及涉及的代謝物

圖10 相關代謝通路

3 討 論

纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸是支鏈必需氨基酸。這3種氨基酸對人類生活至關重要，主要作用于修復機體肌肉，控制血糖，并給身體組織提供能量[3]。一項前瞻性研究顯示，過高的支鏈必需氨基酸(特別是纈氨酸)的攝入與高血壓發病率有較高關聯[4]，過量的纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸累積會抑制葡萄糖代謝，導致胰島素抵抗[3]。而胰島素抵抗可以通過幾種機制來升高血壓：腎吸收鈉增加，交感神經系統的激活，促進成纖維細胞增殖和血管平滑肌細胞合成[5]。反之，高血壓通過改變胰島素和葡萄糖向骨骼肌細胞的輸送，導致葡萄糖攝取受損，加劇胰島素抵抗。L-亮氨酸還可以抑制內皮細胞中L-精氨酸的一氧化氮(NO)合成，6-果糖磷酸氨基轉移酶(GFAT)是合成葡萄糖胺(一種抑制內皮細胞合成NO的抑制劑)中的一種速率控制酶。L-亮氨酸通過增強GFAT蛋白表達，從而抑制內皮細胞中的NO合成[6]。本實驗中SHR血漿內纈氨酸、L-異亮氨酸、亮氨酸相對含量較高與該研究具有一致性，推測SHR的血壓升高或與纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸的過量堆積導致的胰島素抵抗及L-亮氨酸抑制NO的合成有關。

L-精氨酸是一種在體內具有多種功能的氨基酸。可用于生成NO、肌酸、L-谷氨酸和L-脯氨酸等化合物[7]。L-精氨酸是合成NO的唯一底物[8]，而NO通過擴張血管、抑制血管平滑肌增殖等作用降低血壓[9]。精氨酸酶會誘導L-精氨酸分解為鳥氨酸，在病理生理狀態下，例如高血壓和缺血性再灌注等，內皮精氨酸酶活性增加，促進L-精氨酸分解為鳥氨酸，降低L-精氨酸濃度，進一步導致內皮功能障礙[10]。實驗結果表明SHR的L-精氨酸含量低于Wistar大鼠，提示精氨酸的缺乏可能是EH發展的原因之一。

L-谷氨酰胺是精氨酸和脯氨酸代謝中的重要底物。L-谷氨酰胺通過誘導血紅素加氧酶-1、熱休克蛋白和谷胱甘肽表達在循環中發揮抗氧化和抗炎作用，也可作為L-精氨酸的前體促進NO合成[11]。L-組氨酸是組胺和肌肽生物合成的前體，通過脂肪細胞中的核轉錄因子-κB(NF-κB)途徑抑制促炎性細胞因子的表達[12]。本實驗中SHR的組氨酸含量高于Wistar大鼠，提示SHR可能處于炎癥狀態，SHR中L-谷氨酰胺含量高于Wistar大鼠，并且L-精氨酸含量較低，推測SHR存在以L-谷氨酰胺為前體的L-精氨酸合成障礙。

膽汁酸分為初級膽汁酸和次級膽汁酸。初級膽汁酸是肝細胞以膽固醇為原料直接合成的膽汁酸，包括膽酸、鵝去氧膽酸及相應結合型膽汁酸，次級膽汁酸是初級膽汁酸隨膽汁進入腸道，由腸道菌酶催化，經去結合反應，脫去羥基轉化而成[13]。鵝去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、?；侨パ跄懰?、膽酸、?；悄懰岫紝儆诔跫壞懼?。膽汁酸是生理性清潔劑，促進脂類的消化吸收，抑制膽汁中膽固醇的析出，調節膽汁流量和脂質分泌，對于膳食脂肪和維生素的吸收必不可少[14]。膽汁酸是11β-羥化固醇脫氫酶Ⅱ型的內源性抑制劑，當膽汁酸代謝發生障礙反流入血，抑制11β-羥化固醇脫氫酶Ⅱ型活性，導致皮質醇激活鹽皮質激素受體，引發鈉潴留，促進高血壓發展[15-16]，在臨床研究中也發現，高血壓病人總膽汁酸水平在服用不同降壓藥物(氨氯地平和吲達帕胺)后均顯著降低[17]，而高血壓病人總膽汁酸水平相對正常人群較高[18]。本實驗結果顯示，鵝去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、?；侨パ跄懰?、膽酸、?；悄懰岷吭赟HR中均高于Wistar大鼠，可能是因為初級膽汁酸合成過多或者次級膽汁酸合成障礙導致膽汁酸代謝障礙，反流入血以致總膽汁酸水平升高，導致血壓升高。

本實驗考察早期SHR和Wistar大鼠的血漿代謝物差異，為參與高血壓早期階段的主要代謝物及通路提供初步依據。