菌肽寶在食用酒精中的應用研究

李永恒 魯佰成 崔春生 賴銘雪 李 濤 邵召 王瑀 何太波 周娜娜

【關鍵詞】菌肽寶;食用酒精;抑菌劑;發酵

【中圖分類號】TS262 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-0688（2021）09-0042-04

酒精發酵是一個復雜的微生物反應過程[1-2]，淀粉質原料發酵生產食用酒精在發酵過程中雜菌的污染是酒精產率和品質下降的主要原因之一[3-4]。為了提高酒精產率，使用無抗食品級生物抑菌劑是抑制、減少雜菌或者殺滅雜菌在酒精發酵過程中急需解決的重大問題[5]。酒精發酵過程中常見且危害較大的雜菌主要有醋酸桿菌、丁酸菌、枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、野生酵母菌等[5-6]。而且，部分雜菌會代謝產出乙酸和乳酸降低發酵過程中醪液的pH，抑制部分輔料活力，降低酒精的產率[7-8]。傳統酒精企業一般發酵時添加漂白粉、青霉素、安菌泰和克菌靈等含有抗藥性的殺菌劑[9-13]，通過發酵副產物DDGS飼料作為動物營養的重要蛋白質來源，對酒精企業的經濟效益做出重要貢獻。但是，過量的使用以抗生素為主的殺菌劑，會使雜菌產生抗藥性[14-15]，抑菌或殺菌不起作用，嚴重影響酒精發酵效果[16]。

食品級生物殺菌劑菌肽寶是從巴西引進的新一代綠色生物制劑產品，它具有廣譜高效殺菌作用，對酒精發酵中出現的雜菌有較好的抑制作用，解決了食用酒精生產輔料添加合規性問題，它屬于混合型天然抑菌劑，其成分主要是抑制細菌細胞壁合成破壞細菌、野生酵母菌和霉菌的細胞壁，使細胞壁中的糖苷鍵和肽鍵斷裂，最后導致細菌死亡，對革蘭氏陽性菌和棒桿菌極其敏感，抑制力強，效果好。因此，菌肽寶對酒精發酵的有害細菌和乳酸菌、醋菌、丁酸菌有明顯的抑制作用，是目前為止比較有前景的酒精發酵專用抑制劑，并且符合《食品添加劑使用標準》（GB 2760 —2014標準）。

2019年，廣西中糧生物質能源有限公司開展無抗殺菌劑的篩選，歷時半年，將生產上使用的安菌泰與菌肽寶AK200、乳酸鏈球菌素、安菌寧和抑菌康4種無抗產品通過小試和大生產試驗，成功篩選到一種菌肽寶AK200無抗食品級生物殺菌劑。該無抗殺菌劑成功篩選，踐行了中糧集團質量安全管理紅線，解決食用酒精生產中輔料添加合規性問題。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

生產車間陳化水稻液化醪、安菌寧、抑菌康、菌肽寶AK200（山東安茂康生物科技有限公司生產）、乳酸鏈球菌素（浙江新銀象生物工程有限公司生產）、杰能科淀粉酶（杰能科中國生物工程有限公司生產）、隆科特糖化酶（山東隆科特酶制劑有限公司生產）、酸性蛋白酶（廣西樂酵生物科技有限公司生產），發利酒用高活性干酵母（英聯馬利（北京）食品銷售有限公司生產），安菌泰（柳州龍泰科技有限公司生產），氨水（含氮17%）、0.25%葡萄糖、0.5%次甲基藍指示劑、斐林試劑、20%氫氧化鈉、20%鹽酸、65%硫酸，其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

電子天平（梅特勒-托利多公司生產，型號：AL204）、工業天平（湘儀天平儀器設備有限公司生產，型號：TP-20 KF）、數字式黏度計（上海精天電子儀器有限公司生產，型號：NDJ-5S）、快速水分滴定儀（廣州市艾安得有限公司生產，型號AND MF-50）、恒溫水浴鍋（江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司生產，型號：XMTD-204）、攪拌器（天津華興偉業實驗儀器有限公司生產，型號：D-8401型-WT）、精密型臺式pH/電導率測量儀（梅特勒-托利多公司生產，型號：S40）、恒溫培養振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司生產，型號：ZHWY-2102）、容量瓶、電子萬用爐（北京市永光明醫療儀器有限公司生產，型號：一聯電壓，220 V ，功率為1 kW）、三角瓶等。

1.3 試驗方法

1.3.1 食用酒精液化發酵工藝路線簡述

食用酒精液化發酵工藝路線如下：水稻原料→粉碎→拌料→高溫液化→同步糖化發酵→蒸餾→過濾→濾渣烘干→酒糙蛋白飼料→食用酒精[17]。

水稻原料預處理：將一定量的水稻通過預粉碎、分級篩除掉沙石、鐵等其他雜物，再用篩網孔徑為2.0 mm的粉碎機進行粉碎，在粉漿罐中添加工藝水、清液和中水，調配成一定干物濃度的粉漿后輸送至液化工段。

液糖化及發酵：通過管線輸送到粉漿罐內，按一半比例加入耐高溫淀粉酶，物料攪拌混合均勻后進行噴射液化。閃冷后輸送到液化罐，加入另一半淀粉酶，保溫90 min至碘試檢測液化合格。采用同步糖化發酵，即液化醪分別輸入發酵罐和酒母罐，分批添加糖化酶。在活化罐內將活化好的酵母與液化醪連續輸入酒母罐培養一段時間得到酒母醪，成熟的酒母醪與降溫后的液化醪同時流入發酵罐，發酵生產乙醇，發酵70 h成熟后由泵輸送到蒸餾工段。

蒸餾工藝：蒸餾采用五塔差壓精餾流程。粗鎦塔是將原料液進行初步分離，廢醪輸出離心;精塔是對粗塔塔頂收集的酒精進行提濃，排除廢水，用于拌料;脫醛塔和脫甲醇塔主要分離甲醇和醛類物質，得到優質的食用酒精;其他工業酒精和雜醇油通過回收塔流出。精餾工藝采用的是差壓耦合精餾技術。

飼料工段：飼料車間收集粗塔蒸除的廢醪，添加板框過濾或臥螺離心機分離出清液和濕糟。部分清液回配，其余清液濃縮成糖漿，然后與濕糟進行均勻混配，通過管束干燥機干燥，出料水分小于12%，即為飼料（DDGS），再通過二級風送至飼料庫房，包裝。

1.3.2 不同殺菌劑小試發酵試驗

取生產車間液化醪，用65%硫酸調節pH至4.40左右，檢測液化醪固形物含量，分裝已滅菌500 mL的三角瓶（400 g/瓶），搖勻。使用發利酒用活性干酵母為菌種，接種含量為0.1%液化醪，加入糖化酶0.68 kg/t粉、酸性蛋白酶0.06 kg/t粉，以加入5 mg·L-1的安菌泰殺菌劑、乳酸鏈球菌素、菌肽寶AK200、抑菌康、安菌寧5個因素條件進行發酵對比實驗，以酒精度（%vol）、殘總糖（%）、揮發酸（g·L-1）為判定指標，確定適合抑制發酵生產使用的無抗生物殺菌劑。用紗布封口，稱重量，然后置于30 ℃、120 r/min的恒溫搖床中培養，培養8 h后調節溫度至33 ℃，靜止發酵至70 h。發酵期間每天稱1次重量，記錄失重，發酵結束后檢測殘還原糖、殘總糖、酒精度、酵母數等指標，同時進行液相色譜分析檢測。

1.3.3 兩種殺菌劑大生產發酵試驗

在前期小試發酵試驗基礎上，將菌肽寶AK200作為發酵過程中添加的試驗組，生產上現有的安菌泰作為試驗對照組，2020年4月2～10日使用菌肽寶AK200進行生產試驗，與使用安菌泰的發酵成熟醪液的生產數據指標進行對比。入料4 h前，往發酵罐添加2 kg菌肽寶AK200，然后每2 h往酒母罐里添加1 kg菌肽寶;入料4 h前，往發酵罐添加2 kg安菌泰，然后每2 h往酒母罐里添加1 kg安菌泰。

1.4 分析檢測方法

醪液黏度檢測：使用黏度計NDJ-5S;酒母質量檢測：血球計數版法;蒸餾酒分檢測：圓底燒杯蒸餾法;殘總糖、殘過濾總糖、殘還原糖檢測：斐林試劑法;揮發酸、酸度檢測：中和滴定法;發酵成熟醪各試驗組的測定采用高效液相色譜法，色譜條件：色譜柱，伯樂HPX-87H;流動相為0.005 mol /L H2SO4，泵流速為0.5 mL/L，柱溫為65 ℃，RID設置溫度為50 ℃，進樣量為10μL，運行時間為30 min[18-21]。

1.5 計算公式

殘淀粉（%）=（殘總糖-過濾總糖）×0.9[22]

殘糊精（%）=（過濾總糖-還原糖）×0.9[22]

2 結果與分析

2.1 不同殺菌劑小試化學檢測結果

通過使用車間液化醪共進行了3批次重復小試試驗研究，由表1中的檢測結果可以看出，從成熟醪發酵失重、蒸餾酒分及殘糖進行對比分析，安菌泰與菌肽寶AK200酒分一致且略高于其他3種殺菌劑，添加抑菌康的酒分最低，由于抑菌康和安菌寧只能對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑制作用，因此不能起到有效的抑制其他細菌的作用。乳酸鏈球菌素[20]主要抑制枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌和部分的梭菌屬且pH越低效果越好，酒精發酵后pH會有所升高，但會降低抑菌殺菌效果。在產酸方面，抑菌康試驗小組的酸度高，發酵效果不好，抑菌效果不太明顯。總體來說，菌肽寶AK200殺菌劑的效果較好，相比其余3種殺菌劑，其發酵后的殘糖偏低、產酸偏低、酒分偏高。綜合發酵檢測結果，發酵效果依次是菌肽寶AK200>抑菌康>安菌泰>安菌泰>乳酸鏈球菌素。實踐證明，在淀粉質原料酒精發酵中無抗殺菌劑菌肽寶AK200替代原有安菌泰是可行的。

2.2 不同殺菌劑液相色譜檢測結果

從表2可以看出，不同的5種殺菌劑的糖組分除DP4+含量相差較多外，其他還原性糖基本都被酵母利用，琥珀酸和乙酸含量都在可控范圍以內。但是，乳酸鏈球菌素、抑菌康和安菌寧3種殺菌劑的乳酸含量對比其他2種的相差較大，說明發酵過程中可能出現染菌，抑菌殺菌效果不明顯。乙醇與甘油比值是反映酒精發酵水平的一個重要指標，但是食用酒精中雜醇油的含量越低對分離提取效果越好，乙醇相對于副產物甘油的比值越高，說明發酵水平越高[23-24]，必須控制在合理的范圍以內，數據顯示添加菌肽寶Ak200發酵乙醇與甘油之比最高，說明發酵效果最好，副產物較低。

2.3 兩種不同殺菌劑大生產試驗

乙醇生產過程中產生的揮發酸主要是由酵母菌、乳酸菌及醋酸菌代謝生成，衡量乙醇產率的多少主要是看揮發酸含量的多少[20]。因此，生產過程中應盡可能地控制乙醇中揮發酸的含量。由圖1可知，自4月2日4號發酵罐開始使用菌肽寶AK200后，24 h揮發酸逐漸下降，并穩定在0.20 mg·L-1以下，在各項液化出料溫度、發酵溫度可控的前提下，相對前期使用安菌泰效果穩定，未見異常波動。

從表3可以看出，在前段工序生產工藝一致的前提下，使用菌肽寶AK200后各項指標優于安菌泰，升酸差，較安菌泰低0.72 mg·L-1，揮發酸低于0.07 mg·L-1，殘總糖、殘淀粉和殘糊精都有明顯的下降，同時死亡率有所升高。

3 結論與討論

本文使用廣西中糧生物質能源有限公司生產線上陳化水稻粉進行小試和大生產多批次重復發酵試驗，經過生產線上數據對比研究，菌肽寶復合型抑菌劑應用于酒精發酵抑菌控酸效果明顯，能夠及時地替代殺菌劑安菌泰，而且在現有生產工藝不變的情況下，對酵母的乙醇產率幾乎沒有影響，同時降低了殘糖指標，有利于清液干物濃度降低和廢液處理，節省企業生產成本。廣西北海夏季溫度較高，最高達40 ℃，而酒精發酵溫度是影響酵母繁殖代謝的主要原因之一，同時會產生一些其他物質，溫度過高不易抑制雜菌，因此需要加大酵母和殺菌劑的比例，以提高發酵效率和減少損失。

參 考 文 獻

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