PD-1/PD-L1 的糖基化修飾對腫瘤免疫治療影響的研究進展

李 胤（綜述） 陳一葦 陳芳華 張 舒 盧春來△（審校）

（1復旦大學附屬中山醫院胸外科 上海 200032；2復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所 上海 200032）

程序性細胞死亡分子1（programmed cell death-1，PD-1）/程序性細胞死亡分子配體 1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）信號通路所介導的腫瘤免疫逃逸是腫瘤發生和發展的重要機制之一。在腫瘤微環境中，腫瘤細胞可表達PD-L1，通過與PD-1相互作用進而影響效應T 細胞的抗腫瘤活性。抑制或阻斷PD-1/PD-L1 通路可顯著增強T 細胞介導的免疫殺傷活性，進而提高抗腫瘤效應。目前包括Nivolumab、 Pembrolizumab、 Atezolizumab 和Avelumab 在內的針對PD-1/PD-L1 的抑制性抗體已展現出顯著的臨床效益［1-2］，但總體緩解率仍然較低［3-4］。PD-1/PD-L1 介導的免疫抑制與其本身蛋白質表達水平及蛋白質翻譯后修飾密切相關。許多重要的細胞內和細胞外因子，如干擾素γ（intrferon γ，IFN-γ）、轉 化 生 長 因 子 β（tranforming growth factor β，TGF-β）、miR-33a 和 miR-200，可通過轉錄和轉錄后調控影響PD-1/PD-L1 的表達［5-7］。此外，PD-1/PD-L1 存在多個N-糖基化位點，其糖基化修飾顯著影響免疫治療的療效［8-9］。

糖基化修飾是一種常見的蛋白質翻譯后修飾，通過糖基轉移酶的作用將糖類轉移到蛋白質，并和蛋白質上的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程。糖基化修飾的主要類型包括N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化是指聚糖與蛋白質肽鏈中天冬酰胺的自由氨基連接，從而將糖鏈組裝在蛋白質上的過程。O-糖基化則是指聚糖與蛋白肽鏈的絲氨酸或蘇氨酸進行連接來修飾蛋白質。蛋白質糖基化修飾可幫助免疫細胞進行正確的定位與遷移［10］。異常的糖基化修飾與腫瘤的發生、增殖、侵襲、轉移和免疫逃逸等密切相關［11-12］。因此，闡明糖基化修飾對PD-1/PD-L1 分子表達及功能的影響，可以為提高腫瘤免疫治療的療效提供新策略。目前國內針對PD-1/PD-L1 糖基化修飾的相關綜述有限，本文將在此基礎上對PD-1/PD-L1 糖基化修飾在腫瘤免疫治療中的作用進行綜述。

PD-1 糖基化修飾PD-1 為免疫球蛋白超家族中的一員，其主要表達在活化的T 細胞和B 細胞表面，是一個具有268 個氨基酸殘基的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-1 與其配體PD-L1 結合，通過去磷酸化影響下游信號通路上的關鍵分子，從而起到負性免疫應答調節的作用［13］。在正常生理狀態下，PD-1 信號的激活可抑制過激炎癥反應，預防自身免疫性疾病的發生［14］。在腫瘤中，PD-1 信號通路的激活可抑制 T 細胞免疫應答，從而導致腫瘤細胞免疫逃逸［15］。目前為止，PD-1 報道共有4 個N-糖基化位點，分別為N49、N58、N74 和 N116［16］（圖 1）。阻斷任意一個糖基化位點，均會導致PD-1 穩定性下降以及表達水平的下調，提示PD-1 糖基化對維持其穩定性以及表達水平密切相關［9］。此外，PD-1 糖基化可以增強PD-1/PD-L1 的結合能力，阻斷上述任一位點糖基化均會導致 PD-1/PD-L1 結合能力下降［9］。Wang 等［17］利用重組人源PD-1 免疫小鼠后，通過抗體人源化獲得了針對PD-1 的特異性單克隆抗體MW11-h317。該單克隆抗體對PD-1 表現出高度親和力，并能夠有效阻斷PD-1 與PD-L1/L2 的相互作用，誘導T 細胞介導的免疫應答，抑制腫瘤生長。對MW11-h317 與PD-1 的結合位點進行分析后發現，其主要針對PD-1 的N58 糖基化位點。mAb059c 是一種針對PD-1的單克隆抗體，Liu 等［18］發現其重鏈互補決定區（complementarity-determining region，CDR）1/2 區域主要識別PD-1 的N58 糖基化位點，突變N58 糖基化位點可以明顯降低mAb059c 和PD-1 的結合能力。此外，Sun 等［9］構建了針對 PD-1 的 N58 糖基化位點的特異性單克隆抗體STM418，該抗體相比于Nivolumab 和Pembrolizumab 具有更高的親和力，同時能夠顯著抑制PD-1/PD-L1 結合，促進T 細胞激活，提升抗腫瘤效應。

圖1 PD-1/PD-L1 糖基化修飾調控關系模式圖Fig 1 Regulation of the glycosylation of PD-1/PD-L1 in cancer

Okada 等［16］利用規律成簇間隔短回文重復結構（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR 相關蛋白 9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）全基因組敲除技術篩選出一系列同PD-1 表達密切相關的分子，發現其中核心巖藻糖基轉移酶 8（fucosyltransferase 8，FUT8）能夠催化PD-1 巖藻糖基化并調節PD-1 在T 細胞上的表達。基因敲除或抑制FUT8 表達均可明顯降低PD-1 糖基化修飾水平，同時下調PD-1 表達，從而增強 T 細胞介導的抗腫瘤免疫效應。Agrawal 等［19］同時發現在黑色素瘤中，FUT8 可以介導腫瘤轉移，抑制FUT8 可以顯著降低黑色素瘤細胞的侵襲和轉移能力。此外，在經過PD-1 抑制劑Pembrolizumab 治療的轉移性黑色素瘤的患者中，高表達FUT8 的患者預后相對較差［9］。以上研究表明，FUT8 不僅對PD-1 的糖基化修飾和表達起著至關重要的作用，同時也影響腫瘤轉移和抗PD-1 免疫治療的作用，具有重要的研究前景。

嵌合抗原受體T 細胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法是近年來一種新興的治療腫瘤的精準靶向療法，但在實體腫瘤中，CAR-T 細胞免疫療法療效卻不盡人意［20］。一項針對CAR-T細胞PD-1 糖基化修飾的研究表明，抑制CAR-T 細胞PD-1 的N74 位點的糖基化修飾可以顯著提升CAR-T 細胞的殺傷效應，從而提升其在實體腫瘤中的抗癌作用［21］。綜上，靶向PD-1 糖基化修飾在腫瘤治療中具有巨大的潛力。

PD-L1 糖基化修飾PD-L1 可在腫瘤細胞表面表達，其能與活化T 細胞表面PD-1 結合，從而抑制T 細胞的增殖、活化、遷移和細胞毒性作用。經糖基化修飾的PD-L1 相對分子質量為45 000~55 000，而未糖基化修的PD-L1 相對分子質量為33 000。抑制PD-L1 的N-糖基化修飾，可以明顯改變PD-L1 的分子量大小［22］。而抑制O-糖基化修飾則并不出現上述改變，提示PD-L1 同PD-1 一樣，主要表現為高度 N-糖基化修飾［23］。通過質譜法鑒定，PD-L1 共有4 個 N-糖基化位點，包括 N35、N192、N200 和 N219。其中N192、N200 和N219 的糖基化修飾對于維持PD-L1 蛋白穩定性至關重要（圖 1）［22］。非糖基化修飾的PD-L1 較不穩定，其可與糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）結合并被磷酸化后通過泛素/蛋白酶體系統降解，而N192、N200和N219 位點的的糖基化修飾則可產生空間阻遏效應，阻礙GSK3β和PD-L1 的相互作用，進而起到穩定PD-L1 的作用［22］。異常的 PD-L1 糖基化水平同樣會導致PD-L1 表達水平的改變。二甲雙胍可誘導AMP 激 活 蛋 白 激 酶（5’AMP-activated protein，AMPK）同PD-L1 結合并使其磷酸化修飾，導致PDL1 的異常糖基化，進而導致其降解［24］。在前列腺癌和三陰性乳腺癌細胞中，Maher 等［25］發現 Sigma1 分子可以通過促進PD-L1 的糖基化而上調PD-L1 的表達水平。抑制 Sigma1 可抑制 IFN-γ 介導的 PD-L1 的表達。在膠質瘤中，PD-L1 共同分子伴侶FKBP51s同樣可以通過促進PD-L1 的糖基化而上調PD-L1 的表達水平。抑制FKBP51s可以顯著降低PD-L1的表達［26］。而促進PD-L1的糖基化水平，可以明顯提高其表達水平，提示PD-L1 糖基化同時對其表達起正性調控作用［27］。研究還發現，上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）可通過 β-catenin 信號軸誘導腫瘤干細胞高表達N-糖基轉移酶STT3，進而增加PD-L1 糖基化，導致腫瘤干細胞PD-L1 上調和腫瘤免疫逃逸［28］。KYA1797K 抑制劑則可以抑制βcatenin/STT3 信號軸而影響PD-L1 糖基化，從而進一步抑制免疫逃逸并誘導腫瘤干細胞凋亡［29］。在此基礎上，Chan 等［30］發現 IL-6 可以誘導 JAK1 磷酸化PD-L1 的Y112 位點，而該位點的磷酸化有助于STT3A 催化 PD-L1 糖基化，而阻斷 IL-6/JAK1 信號軸可以抑制STT3A 同PD-L1 結合，導致PD-L1降解。

PD-L1 的糖基化修飾和其與PD-1 的結合以及免疫抑制密切相關，阻斷PD-L1 糖基化可以顯著提升抗腫瘤效應。利用N-糖苷酶（PNGase F）水解PD-L1 的糖 鏈 后，PD-1/PD-L1 結 合 能 力 喪 失［23］。將T 細胞同表達糖基化和表達非糖基化PD-L1 的乳腺癌細胞進行共培養后，發現表達非糖基化PDL1 的乳腺癌細胞凋亡更為顯著。進一步研究發現在BALB/c 小鼠體內，野生型PD-L1 細胞相比于PD-L1 糖基化位點突變細胞生長更為迅速，而將上述細胞接種到免疫缺陷小鼠后生長速度相似，表明糖基化對PD-L1 的免疫抑制功能十分重要［23］。阻斷PD-L1 的糖基化同時還可以影響PD-L1 正確轉運至細胞膜上。Verdura 等［31］發現白藜蘆醇可以靶向破壞PD-L1 糖鏈并影響其二聚化，從而導致其無法被正確轉移至細胞膜上。在三陰乳腺癌中，糖基轉移酶B3GNT3 表達顯著升高且與預后密切相關。B3GNT3 受到上游EGF/EGFR 信號的激活而促進PD-L1 的 N192 和 N200 位點糖基化，從而確保 PD-1/PD-L1 結合［32］。通過構建單克隆抗體藥物偶聯復合 物 STM108-ADC 針 對 PD-L1 的 N192 和 N200 糖基化位點，可以顯著抑制腫瘤活性［32］。此外，Liu等［33］發現在B 細胞淋巴瘤中，糖基轉移酶GLT1D1同樣可以促進PD-L1 的N-糖基化水平，并損害細胞毒性 T 細胞對腫瘤細胞的殺傷功能。Shao 等［34］發現2-脫氧葡萄糖（2-deoxyglucose）可以作為葡萄糖類似物降低PD-L1 的糖基化水平，從而拮抗PARP抑制劑誘導的糖化PD-L1 表達。在此基礎上，Kim等［35］發現 2-脫氧右旋葡萄糖（2-deoxy-D-glucose）可以同樣可誘導PD-L1 去糖基化，并增強4‐1BB 介導的抗腫瘤效應。

常規情況下，PD-L1 表達小于1%的患者一般不推薦使用 PD-L1 治療［36］。由于 PD-L1 糖基化的存在，通常會造成臨床檢查假陰性出現。移除PDL1 糖基化修飾可以提高檢測率，更好地指導臨床用藥，同時在一定程度上對患者的療效進行預測［37-38］。以上研究表明，針對PD-L1 糖基化修飾的抗腫瘤治療具有一定的臨床應用前景。

結語近年來，基于阻斷PD-1/PD-L1 的免疫治療手段飛速發展，已經逐步在臨床推廣和應用，但其治療緩解率仍然相對較低。隨著針對PD-1/PD-L1 糖基化修飾研究的不斷深入，人們發現糖基化修飾對PD-1/PD-L1 的穩定性和相互作用起著至關重要的作用，同時也是腫瘤細胞免疫逃逸的重要機制之一。不僅如此，一些能夠催化PD-1/PD-L1 糖基化修飾的糖基轉移酶也被發現參與腫瘤侵襲和轉移，并且與腫瘤患者的預后密切相關。因此，開發針對PD-1/PD-L1 糖基化為靶點的治療手段具有明顯優勢，有望成為腫瘤治療的新途徑和新方法。

作者貢獻聲明李胤 論文構思、撰寫和修訂，文獻回顧，圖表繪制。陳一葦，陳芳華 文獻回顧，論文撰寫和修訂。張舒 論文構思和修訂。盧春來 論文構思、撰寫和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。