TIMP2 和IGFBP7 的生物學功能及其在腎臟損傷過程中作用的研究進展

張 楊 （綜 述） 王一梅 姜物華 趙 栓 丁小 強 △（審 校）

（1復旦大學附屬中山醫院腎內科 上海 200032；2上海市腎病與透析研究所 上海 200032；3上海市腎臟疾病與血液凈化重點實驗室 上海 200032）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是指腎臟功能在短期內惡化（以腎小球濾過率快速下降為特點）的一組以代謝廢物毒素蓄積、體液潴留、電解質酸堿平衡紊亂等為特征的臨床綜合征。根據全球AKI 流行病學Meta 分析顯示，成年住院患者發病率為21.6%，病死率為23.9%。兒童住院患者發病率高達 33.7%，病死率為 13.8%［1］。2015 年我國一項2 223 230 例的多中心臨床調查顯示，AKI 住院病死率為12.4%，另有16.1%的住院患者出院時仍有嚴重AKI，高達74.2%的AKI 患者住院期間未被診斷，而被診斷的患者中有17.6%診斷滯后［2］。目前對AKI 仍然沒有有效的治療方法，主要原因在于AKI 發病原因復雜，難以精確預測或早期診斷。

生物標志物是臨床預測和診斷AKI 的重要指標，主要包括血肌酐、尿素氮、尿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）、腎 損 傷 分 子 1（kidney injury molecule-1，KIM-1）、尿 IL-18、金屬蛋白酶組織抑制因 子 2（tissue inhibitors of metalloproteinase 2，TIMP2）和胰島素樣生長因子結合蛋白7（insulinlike growth factor binding protein 7，IGFBP7）等［3］。其 中 ，尿 液 TIMP2 和 IGFBP7 濃 度 的 乘 積（［TIMP2］·［IGFBP7］）在 AKI 早期顯著升高，因此在預測 AKI 發生方面優于其他標志物［3］。［TIMP2］·［IGFBP7］在危重患者及心臟手術后患者AKI 風險預測中表現良好［4-6］，同時該指標能很好地預測膿毒血癥 AKI 患者的預后結局［7］，且一般合并癥（如糖尿病、充血性心力衰竭、慢性腎臟病）不會影響這一指標對 AKI 的風險評估［8］，其在 2014 年被 FDA 批準用于 AKI 的臨床預測。但是，TIMP2 和 IGFBP7 的生物學功能是什么，TIMP2 和IGFBP7 為何能夠預測AKI 的發生，二者在正常以及損傷后的腎臟中有何作用等問題都尚未明確。因此本文通過分析TIMP2 和IGFBP7 所屬蛋白家族的特點及已報道的生物學功能，對TIMP2 和IGFBP7 在腎臟中除生物標志物之外的作用和功能進行深入解析。

TIMP2 的生物學特征和功能

TIMPs 家 族 與 TIMP2 TIMP2 屬 于 TIMPs 家族，該家族由4 個成員組成（TIMP1~4），為內源性基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的抑制因子。各成員對MMPs 的抑制能力和范圍存在差異，TIMP3 的抑制作用最廣泛，TIMP2 其次，而 TIMP1 范圍最窄（表 1）。TIMPs 通過調控MMPs 的活性調節細胞外基質的代謝、組織的重塑和細胞行為等生物過程；還通過非MMP 依賴性途徑參與細胞增殖、分化、凋亡、遷移、血管形成等生命過程，例如TIMP2/3 具有調節細胞凋亡的作用［9］。

表1 人TIMP 家族成員的生物學功能簡介Tab 1 Biological functions of the human TIMPs

在基因組中，TIMP1、3 和 4 的編碼基因與突觸相關蛋白編碼基因的內含子存在部分重合，而編碼TIMP2 的 基 因 與 編 碼 DDC8（differential display clone 8）基因部分重合。DDC8 在睪丸等組織中表達，與TIMP2 共同參與精子生成、腦皮質損傷修復等過程［10］。

TIMP2 的蛋白結構及表達部位 人TIMPs 蛋白由 N 端和 C 端結構域組成［11］：N 端中間區域的氨基酸序列極為保守，是結合 MMPs 的主要部位［12］；C端結構域則在pro-MMP2 激活過程中起重要作用［13］。TIMP2 在正常機體內的多個器官中表達，多表達于生殖系統及膀胱中，而腎臟中較少［14］。

TIMP2 對細胞增殖的影響及機制 TIMP2 能夠促進細胞增殖。在細胞質中，TIMP2 的C 端結構域與MMP2 前體（pro-MMP2）結合形成復合物，在MMP14 的作用下成為成熟的 MMP2［13］。TIMP2 同時對MMP2 活性具有抑制作用，這受到細胞膜中TIMP2、細胞外基質以及MMP14 三者含量的調控［9］。研究發現 TIMP2 通過激活蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）及 磷 脂 酰 肌 醇 3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號途徑促進細胞生長［15］。游離在細胞外的TIMP2 通過結合細胞表面的MMP14，激活細胞外調節蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2），促進細胞生長［16］。在肺腺癌中，TIMP2 通過 c-Src 激酶的活化，激活黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）、PI3K/AKT、ERK1/2 通路，促進腫瘤細胞增殖［17］。TIMP2基因敲除小鼠表現為中樞神經系統和肌生成缺陷，如神經元分化延遲、運動系統功能異常、肌力降低等［9］。

另一方面，TIMP2 具有抑制細胞增殖的功能。TIMP2 通過結合內皮細胞表面的 α3β1整合素，抑制血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）和成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）的激活，同時激活腺苷酸環化酶，增加細胞內環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，激活含SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶1（SH2-containing protein tyrosine phosphatase-1，SHP-1），使 VEGF/FGF 受體去磷酸化［9，18］。TIMP2 通過促進 p27Kip1的合成進而抑制 CDK4（cyclin-dependent kinase 4）和CDK2，最 終 使 內 皮 細 胞 周 期 停 滯 于 G1 期［18］。TIMP2 通過抑制細胞周期蛋白B 和D 的表達，促進CDK 抑制因子p21Cip的生成，抑制神經元細胞進入細胞周期，促進細胞分化［19］。TIMP2 還可以通過抑制 Wnt （wingless-type MMTV integration site family）/β-catenin 通路來抑制腫瘤細胞的增殖［20］。除通過上述MMP 非依賴機制外，TIMP2 還可以通過抑制MMPs 調節細胞外基質，抑制血管內皮細胞增殖，進而抑制血管形成［9，18，21］。

TIMP2 在腎臟中的作用及其機制 TIMP2 參與腎臟發育過程。輸卵管芽通過分泌TIMP2 抑制MMPs 的活性，導致細胞外基質沉積，從而抑制輸尿管芽的生長。膠質細胞系來源的神經營養因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）和成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor 7，FGF7）在腎臟發育早期通過促進輸尿管芽分泌TIMP2，抑制腎間充質干細胞的凋亡［22］。

TIMP2 參與腎臟免疫調節過程。在脂多糖誘導的人近端腎小管上皮細胞損傷以及AKI 小鼠模型中，下調TIMP2 可以抑制p65 磷酸化，進而抑制NFκB（nuclear factor kappa B）通路，減少細胞因子釋放和細胞凋亡，因而TIMP2 下調在內毒素引起的AKI 中對腎臟具有保護作用［23］。研究發現，在缺血或甘油誘導的腎損傷小鼠模型中，尿液TIMP2、IGFBP7 含量明顯上升，但腎臟中TIMP2 和IGFBP7 的 mRNA 水平并未增加，因而 AKI 發生時腎小管濾過增加、重吸收減少使近曲小管TIMP2 和IGFBP7 分泌量增加，而并非由TIMP2 和IGFBP7表達量增加所致［24］。

IGFBP7 的生物學特征和功能

IGFBPs 家族與IGFBP7 胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）的結構與胰島素相似，具有有絲分裂原的作用，可調控細胞增殖和代謝。根據與IGF的親和性，IGF結合蛋白（IGF binding protein，IGFBP）超家族主要分為高親和性的IGFBP1~6 和低親和性的IGFBP 相關蛋白（IGFBP-related protein，IGFBP-rP），IGFBP7 屬于后者［25］。

IGFBPs 結構和功能 傳統意義上的IGFBPs（IGFBP1~6）富含半胱氨酸，由 N 端、中間區域、C端這3 個結構域組成。其中N 端、C 端高度保守，中間區域具有可變性。N 端含有一段極為保守的“GCGCCXXC”氨基酸序列，與 IGF 親和力有關［26-29］。

IGFBP 作為 IGFs 的轉運蛋白，調節 IGFs 的功能與活性，延長IGFs 在體液中的半衰期。IGFs 若被定位在細胞膜上，IGFBP 募集則有助于與IGF 受體結合，而若被胞外游離的IGFBP 結合則不利于與IGF 受體結合［30］。這些作用通過 IGFBP 中間區域的磷酸化［31］和IGFBP 蛋白酶降解等機制進行調節。IGFBP 可以直接通過調節細胞分泌生長因子、與細胞表面非IGF 受體直接作用、入核調控基因轉錄以及鞘磷脂作用途徑等多種機制調控細胞凋亡、增殖、存活、衰老和自噬等過程［32-34］。

IGFBP-rP 在結構和功能上與IGFBP1~6 類似，因此也被列入IGFBP 家族。IGFBP-rP 具有保守的N 端結構域，但是缺少C 端結構域和中間結構域，雖然能夠結合IGF 但親和力比IGFBP1~6 低，因而被稱為IGFBP-rP。成員包括IGFBP7、結締組織 生 長 因 子（connective tissue growth factor，CTGF）、IGFBP-rP3 和 IGFBP-rP4［35-38］等。

IGFBP7 的分布 IGFBP7 分布非常廣泛，在外周神經、平滑肌細胞（包括血管壁、消化道、膀胱、前列腺）、呼吸系統纖毛、附睪以及輸卵管中都有較強的免疫熒光染色，各臟器中腎臟表達最多［14］。幾乎所有的上皮細胞都有不同程度的IGFBP7 表達，在血漿、尿液、羊水、腦脊液等體液中IGFBP7 均可被檢測到［39］，但脂肪細胞、漿細胞和淋巴細胞內沒有表達。腎臟中IGFBP7 在不同細胞類型中的分布不同，其中腎小球表達量最低，遠曲小管中的表達高于近端小管［40］。也有研究發現IGFBP7 在近端小管表達較強，并且定位在部分近曲小管的刷狀緣［41］。

IGFBP7 的結構 IGFBP7 的 N 端結構 域具有IGFBP 家族特點，含有“GCGCCXXC”肽段，而 N 端結構域之外的序列與IGFBP 家族其他成員的同源性僅為15%［25］。近N 端有一段氨基酸序列與Kazal家族絲氨酸蛋白酶相似，稱為KI（Kazal-type serine proteinase inhibitor）結構域［25］，這段序列還與卵泡抑素高度同源。KI 結構域之后的序列與成纖維細胞生長因子受體中的免疫球蛋白樣結構類似，該序列與硫酸乙酰蛋白肝素具有同源性［42］（圖1）。傳統IGFBP 與IGF 的結合需要N 端和C 端結構域共同參與。由于 IGFBP7 缺少 C 端結構域，IGFBP7 與IGF 的親和力僅為傳統 IGFBPs 的 1%［43］。C 端結構域的缺失還造成N 端結構域中的胰島素結合位點暴露［44］（圖 2），因而 IGFBP7 與胰島素的親和力比IGFBP 家族其他成員更強。綜上，IGFBP7 可能通過非IGF 途徑發揮生物學功能。

圖1 IGFBPs 和IGFBP-rPs 的構成與簡化結構Fig 1 The composition and simplified structure of IGFBPs and IGFBP-rPs

圖2 IGFBP/GFBP-rP 與胰島素結合機制Fig 2 The mechanism of IGFBP/IGFBP-rP binding to IGF

IGFBP7 的功能及作用機制 IGFBP7 參與細胞黏附和腫瘤細胞增殖等過程。轉化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）和維甲酸等能上調前列腺上皮細胞中的IGFBP7［25］。同時，IGFBP 降解后的N 端片段仍具有細胞膜黏附的作用［45］。IGFBP7 能夠與 Activin 結合，調節腺體組織的生長發育和卵泡刺激素的生成［46］。IGFBP7 能夠與Ⅳ型膠原結合，促進臍靜脈內皮細胞的黏附和形態改變［47］。IGFBP7 定位于細胞表面，與蛋白聚糖作用，促進細胞黏附于纖連蛋白和黏連蛋白5 等［48］（圖3）。IGFBP7 通過調控細胞周期參與細胞增殖。在腫瘤領域，IGFBP7 可以通過抑制細胞周期蛋白D1 和 p21 的表達，并促進細胞周期蛋白 A、E、p16、p27 表 達［48-50］，或 通 過 抑 制 Akt 的 激 酶 活 性 ，引 起CDK 抑制因子 p27Kip1和 p21Cip1上調［51］，誘導細胞停滯于G0/G1 期。細胞內過表達或細胞培養液中添加外源IGFBP7，可以通過非IGF-I 受體、AKT、ERK 途徑誘導細胞停滯于G2 期，進而導致細胞凋亡［52］。IGFBP7 還可以通過提高SMARCB1（SWI/SNF related，matrix associated，actin dependent regulator of chromatin，subfamily B，member 1）水平，進而提高BNIP3L（BCL2 interacting protein 3 like）水平，同時抑制 BRAF-MEK-ERK 通路，誘導細胞衰老和凋亡［53］。IGFBP7 還可以通過絲裂原活化 蛋 白 激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路抑制IGF 對細胞的促分化作用，但不影響 IGF 的促增殖作用［54］。

圖3 IGFBP7 的作用與調節Fig 3 The functions and regulation of IGFBP7

IGFBP7 在腎臟損傷中的作用 IGFBP7 參與多種腎臟病的發生發展。敗血癥引起的AKI 中，IGFBP7 通過激活ERK1/2 及通路相關蛋白，如細胞 周 期 蛋 白 D、p21、Bcl-2、Bax（BCL2 associated X），誘導細胞停滯于 G0/G1 期［55］。在糖尿病腎病中，TGF-β1 通過SMAD2（a family of proteins similar to the drosophila mothers against decapentaplegic，member 2）和 SMAD4 上調 IGFBP7 表達，同時上皮標志物E-cadherin 下調，間充質標志物α 平滑肌肌動蛋 白（α smooth muscle actin，α -SMA）上 調 。IGFBP7 的敲除可以抑制TGF-β1 誘導的上皮向間充質細胞轉化，緩解腎纖維化［56］，這與 IGFBP7 在肝纖維化中的實驗結果一致［57］，這一機制在糖尿病腎病的腎纖維化中也存在［58］。

綜上所述，TIMP2 和IGFBP7 都參與細胞的增殖和凋亡過程［59-60］，目前研究集中在腫瘤領域，而缺少腎損傷領域的研究。 今后的研究重點：（1）TIMP2 和 IGFBP7 在 AKI 引起細胞周期停滯中的作用；（2）TIMP2 和 IGFBP7 為何上調，如何反映腎臟損傷，能否作為治療靶點；（3）基于TIMP2、IGFBP7 細胞周期抑制/促進機制、表達分布差異、隨腎損傷程度的變化、蛋白分布的變化等研究，有助于指導對腎損傷不同病因、不同程度、不同部位（如近端小管、遠端小管、集合管或間質）的診斷。

結語TIMP2 和IGFBP7 本身功能多樣、作用機制復雜，與細胞增殖和凋亡的關系密切。在AKI發生早期，二者在尿液中的含量顯著升高，TIMP2可 能 通 過結合 α3β1整 合 素 受 體、促進 p27Kip1和 p21Cip合成、Wnt/β-catenin 通路等機制調控細胞周期；IGFBP7 可能通過與Ⅳ型膠原結合、與蛋白聚糖作用參與細胞黏附，通過調節p21、p27、ERK1/2 等蛋白參與細胞增殖。尿液中二者的增加也可能是由腎小管上皮細胞分泌/重吸收功能的異常所引起。在AKI 中下調TIMP2 對腎臟有潛在的保護作用，上調IGFBP7 則具有潛在促進纖維化的作用。TIMP2 與IGFBP7 作為目前 FDA 認證的臨床 AKI早期標志物，研究其在AKI 過程中的生物學功能，對AKI 的早期診斷及治療具有重要的指導意義。

作者貢獻聲明張楊 文獻調研，圖表繪制，論文構思、撰寫和修訂。王一梅，姜物華 論文校審和修訂。趙栓，丁小強 論文指導和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。