模擬消化對乳清肽結構和抗氧化活性的影響

馮曉文，趙曉涵，程青麗，潘驍琪，劉文穎*

（1.中國食品發酵工業研究院有限公司北京市蛋白功能肽技術研究中心，北京 100015；2.北京城市學院生物醫藥學部，北京 100094）

乳清蛋白是利用現代先進工藝從牛奶中分離提取出來的一類蛋白質，主要成分為β-乳球蛋白（βlactoglobulin，β-LG）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）、免疫球蛋白、血清蛋白、乳鐵蛋白等，其中免疫球蛋白具有抗氧化、提高免疫力的作用[1]。此外，乳清蛋白中還含有豐富的半胱氨酸、蛋氨酸等含硫氨基酸，能很好地維持體內谷胱甘肽（glutathione，GSH）的水平，發揮抗氧化作用[2]。

乳清肽是以乳清蛋白為原料經酶解工藝制得，與乳清蛋白相比，具有更好的起泡性、乳化性，且更易被機體吸收、轉運和利用[3]。已有研究表明，乳清蛋白經消化吸收后，產生的部分蛋白質片段和肽類也具有生物活性和功能[2]，例如抗氧化活性、調節血糖功能及血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性等[1，3-4]，而關于體外模擬消化對乳清肽結構和抗氧化活性的影響鮮有研究和報道。基于此，本研究以乳清肽為研究對象，通過體外模擬胃腸道消化，以分子質量分布、紫外全波長掃描、圓二色光譜（circular dichroism，CD）揭示消化前后乳清肽結構的變化；以DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）及氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）4個抗氧化指標結果揭示消化前后乳清肽抗氧化活性的變化。以期為乳清肽在食品方面的多元化開發提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清粉：北京中食海氏生物技術有限公司；堿性蛋白酶（20 000 U/g）、中性蛋白酶（200 000 U/g）、胃蛋白酶（3 000 U/g）：諾維信生物技術有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、過硫酸鉀、醋酸鈉：北京化學試劑公司；胰蛋白酶（74 000 U/g）：南寧龐博生物有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽[2，2′-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH]、熒光素鈉、水溶性維生素 E（Trolox）：美國 Sigma公司；2，2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：南京森貝伽生物科技有限公司；2，4，6-三吡啶基-1，3，5-三嗪 [2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：酷爾化學科技（北京）有限公司；三氯化鐵、硫酸亞鐵：西隴化工股份有限公司。以上化學試劑均為分析純。

YG30型噴霧干燥機：無錫市陽光干燥設備廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋：普瑞斯機械有限公司；FE20K型pH計：瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-250E超聲波振蕩器：昆山市超聲儀器有限公司；J-810圓二色光譜儀：美國Jasco公司；Spectra MR多功能酶標儀：美國Dynex公司；SpectraMax i3x多功能酶標儀：美國MD公司；LC-20AD型高效液相色譜儀：日本島津公司；UV-1780紫外可見分光光度計：日本SHIMADZU公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清肽的制備

乳清肽經兩步酶解法制得。精確稱取50 g乳清粉于1 000 mL蒸餾水中，混勻，90℃加熱10 min，降溫至55℃，使用pH計調節溶液的pH值為8.5，然后加入堿性蛋白酶0.40 g，酶解3 h；調節溶液的pH值為7，溫度為45℃，加入中性蛋白酶0.45 g，酶解2 h。酶解完畢，高溫滅酶15 min。冷卻至27℃，10 000 r/min離心30 min，棄沉淀。用截留分子質量為1 000 Da的超濾膜超濾上清液，得分子質量小于1 000 Da的濾過液，然后在進料溫度25℃、進料速度14 mL/min、進風口溫度135℃、進風壓力20 kPa條件下進行噴霧干燥，得到乳清肽干粉[3]。

1.2.2 體外模擬胃腸道消化試驗

1.2.2.1 胃蛋白酶消化試驗

配制質量濃度為50 mg/mL的乳清肽溶液100 mL，取20 mL 1 mol/L的HCl溶液調節pH值為2，于37℃水浴鍋中加熱2 min，加入3%（質量分數）胃蛋白酶（≥250 U/mg），混勻，37℃下邊攪拌邊消化3 h，然后100℃滅酶10 min，待樣品冷卻至27℃后，進行后續試驗，此為模擬胃液組。另取消化前樣品作為對照組[5]。

1.2.2.2 胰蛋白酶消化試驗

取1.2.2.1配制的乳清肽溶液20 mL于離心管中，使用pH計調節pH值為6.8，37℃水浴加熱1 min，加入3%胰蛋白酶（≥250 U/mg），混勻。37℃水浴鍋中邊攪拌邊消化3 h，100℃滅酶10 min。冷卻至27℃后，進行后續試驗，此為模擬胰液組[5]。

1.2.2.3 先胃蛋白酶消化后胰蛋白酶消化試驗

按1.2.2.1步驟進行胃蛋白酶消化后，調節pH值為6.8，37℃水浴加熱1 min，加入3%胰蛋白酶（≥250 U/mg），混勻，于37℃水浴中邊攪拌邊消化3 h，100℃滅酶10 min。待冷卻至27℃后，進行后續試驗，此為先胃后胰組[5]。

1.2.3 分子質量分布測定

分子質量分布采用高效凝膠過濾色譜法測定。色譜條件為色譜柱：TSKgelG2000SWXL300mm×7.8mm；流動相：乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1（體積比）；流速：0.5 mL/min；進樣體積：10 μL；檢測波長：220 nm；柱溫：30℃；紫外檢測器檢測。使用1 mg/mL的樣品溶液進行測定，樣品溶液經流動相配制，然后經孔徑0.2 μm聚四氟乙烯過濾膜過濾后，用高效液相色譜儀進行凝膠過濾，數據使用GPC軟件處理。以乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子質量189 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子質量451 Da）、桿菌酶（分子質量1 450 Da）、細胞色素C（分子質量12 500 Da）為肽標準品，配制質量分數0.1%溶液，過膜后進樣，繪制相對分子質量校正曲線[6]。

1.2.4 紫外全波長掃描

將所測溶液的質量濃度稀釋為2.0 mg/mL，移取部分于石英比色皿中，利用紫外可見分光光度計進行紫外全波長掃描，掃描條件為掃描波長245 nm～325 nm；狹縫寬度1.0 mm；采樣間隔0.5 nm；慢速掃描。

1.2.5 圓二色光譜掃描

配制質量濃度1.0 mg/mL的樣品溶液，移取部分于石英比色皿中，使用圓二色光譜儀測定其二級結構組成，圓二色光譜條件：光源采用氙燈；氮氣輸出壓力為0.4MPa；帶寬1.0nm；光譜測量范圍180 nm～260 nm；步進0.5 nm；數據點采樣時間0.25 s。對蛋白樣品進行圓二色光譜采集，每個樣品采集3次，用CDNN 2.1-Simple Spectra軟件分析樣品圓二色光譜圖，從而得出溶液中二級結構的組成與含量。

1.2.6 DPPH自由基清除能力測定

將不同處理組的樣品溶液用超純水分別稀釋為1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 mg/mL，向 0.1 mL 的樣品溶液中加入0.1 mL的無水乙醇溶液，此為空白組；向0.1 mL的樣品溶液中加入0.1 mL的DPPH-無水乙醇溶液，此為樣品組；向0.1 mL的蒸餾水中加入0.1 mL的DPPH-無水乙醇溶液，此為對照組。每組樣品做3組重復，搖床晃動96孔板使反應體系混勻，25℃避光反應30min，然后于517 nm處測定吸光值，DPPH自由基清除率根據式（1）進行計算[7-9]。

式中：AX為樣品組吸光值；A0為空白組吸光值；A1為對照組吸光值。

1.2.7 ABTS＋自由基清除能力測定

參照Rezanejad等[10-11]的方法，并略作修改。將ABTS＋自由基儲備液和過硫酸鉀溶液等體積混合，25℃過夜便得ABTS工作母液。稀釋ABTS工作母液后得ABTS工作液。向0.2 mL ABTS工作液中加入10 μL不同濃度的Trolox標準溶液，此為標準組；向0.2 mL ABTS工作液中加入10 μL的1 mg/mL樣品溶液，此為樣品組；向0.2 mL ABTS工作液中加入10 μL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS），此為空白組。每組試驗做3組平行，晃勻反應液。25℃避光反應5 min，734 nm處測定OD值。以不同濃度的Trolox標準溶液OD值為縱坐標，Trolox濃度為橫坐標制得標準曲線，根據標準曲線可得樣品的ABTS＋自由基清除能力，單位以mmol Trolox/g表示。

1.2.8 FRAP值測定

根據Amjadi等[12-13]的方法測定樣品的還原能力，并稍作修改。將醋酸鈉緩沖液、TPTZ溶液和FeCl3溶液按一定比例混合得FRAP工作液。37℃條件下，向0.18 mL的FRAP工作液中加入5 μL的PBS，此為空白組；向0.18 mL的FRAP工作液中加入5 μL的不同濃度的FeSO4標準溶液，此為標準樣品組；向0.18 mL的FRAP工作液中加入5 μL的1 mg/mL的樣品溶液，此為樣品組。每組做3個平行，晃勻96孔板。37℃下反應5 min，于593 nm處測定各孔OD值，由FeSO4標準溶液及對應的OD值繪制標準曲線，并計算樣品的鐵離子還原能力，單位以μmol FeSO4/g表示。

1.2.9 ORAC值測定

取96孔板，于標準溶液孔中加入25 μL不同濃度梯度的Trolox標準溶液，空白孔和對照孔中分別加入25 μL 75 mmol/L PBS，樣品孔加入 25 μL 的 1 mg/mL的樣品，每組重復3次。各孔在避光條件下迅速加入100 μL 0.8 μmol/L的熒光指示劑，混勻，96孔板作遮光處理，37℃反應20 min。反應完畢，空白孔中加入75 μL的 PBS，其余各孔迅速加入 75 μL 150 mmol/L AAPH溶液。在激發波長485 nm和發射波長530 nm下測定各組樣品的吸光值。通過處理標準品的吸光值得到不同濃度Trolox的動態熒光衰減曲線，然后計算樣品的ORAC值，結果表示為μmol Trolox/g[14-15]。

據知情人回憶，黎永蘭的教學成績優異，她所帶班級在廣安名列前茅。2003年，黎永蘭參加了公務員考試，告別講臺成為一名公務員，先后在廣安大有鄉、龍臺鎮等地擔任了副鄉長、鎮長等職務，“工作很有一套”。

1.3 數據處理

每組數據平行測定3次，結果用平均值±標準差表示，使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 消化前后乳清肽的分子質量分布

乳清肽經體外模擬胃腸道消化后的分子質量分布結果見表1。

表1 不同處理的乳清肽的分子質量分布Table 1 Molecular weight distributions of whey peptides with different treatments

由表1可知，不同處理組中，分子質量范圍在150 Da～1000Da的組分所占比例最大，均高于80%。與未消化組相比，先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后3000Da～5 000 Da的組分減少了97.44%，推測其原因可能是這一范圍的肽鏈含有較多的胃蛋白酶識別位點。經過胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后，分子質量范圍在150 Da～1 000 Da的組分含量均有所增加，重均分子質量下降，但下降幅度不超過16.26%。推測其原因可能是胰蛋白酶將大分子質量的多肽或蛋白質水解成分子質量較小的短肽及氨基酸。張韋唯[16]同樣通過體外模擬胃腸液消化處理發酵菜粕抗氧化肽，其中分子質量小于1 000 Da的組分在消化后有所增加，與乳清肽變化規律一致。Zhang等[17]通過模擬胃腸液消化得到的大豆蛋白水解物，其小于1 000 Da的組分較消化前相比有所增加，與本試驗變化趨勢一致。

2.2 消化前后乳清肽的紫外全波長掃描

消化前后乳清肽的紫外全波長掃描結果見圖1。

圖1 不同處理的乳清肽的紫外全波長掃描Fig.1 Ultraviolet full wavelength scanning of whey peptides with different treatments

如圖1所示，4組樣品在280 nm附近均有一個不明顯的吸收峰，且在經模擬胃腸液消化處理后，較未消化組相比，模擬胃液組和模擬胰液組乳清肽在280 nm處的吸光值升高。280 nm附近OD值的變化與色氨酸和酪氨酸的芳香雜環π-π*躍遷相關，消化后乳清肽溶液的紫外吸收峰值升高，則表明乳清肽在消化后，溶液中色氨酸和酪氨酸殘基的芳香雜環的π-π*躍遷發生了變化，從而使得紫外吸收峰值發生了變化[18]。

2.3 消化前后乳清肽的圓二色光譜掃描

消化前后乳清肽的圓二色光譜掃描結果見圖2。

圖2 不同處理的乳清肽的圓二色光譜圖Fig.2 Circular dichroism spectrogram of whey peptides with different treatments

用CDNN 2.1-Simple Spectra軟件對所得的CD圖進行分析，得到相應的二級結構組成，如表2所示。分析表2可得，乳清肽在模擬胃腸液消化處理以后，α-螺旋較未消化組相比有所增加，最大增加比例為15.48%；β-折疊在模擬胃腸液消化處理后較未消化組相比所占比例有所降低，最大降幅為31.88%；β-轉角、無規則卷曲消化前后變化不明顯。可得，乳清肽的二級結構組成對胃蛋白酶和胰蛋白酶消化均有很好的穩定性。乳清肽中α-螺旋含量少，而無規則卷曲的含量多，則其無序性較高且結構比較松散[19-20]。

表2 不同處理的乳清肽的二級結構Table 2 Secondary structures of whey peptides with different treatments

2.4 消化前后乳清肽的DPPH自由基清除能力

消化前后乳清肽的DPPH自由基清除能力結果見圖3。

圖3 不同處理的乳清肽的DPPH自由基清除活性Fig.3 DPPH free radical scavenging activities of whey peptides with different treatments

如圖3所示，乳清肽的DPPH自由基清除能力在經模擬胃液消化前后未發生明顯改變，表明乳清肽的DPPH自由基清除能力具有很強的抗胃蛋白酶消化穩定性；但是，模擬胰液組及先胃后胰組較未消化組相比，其DPPH自由基清除能力大幅度降低，在濃度10mg/mL時，未消化組DPPH自由基清除率為91%，而先胃后胰組在同濃度下DPPH自由基清除率為33%，原因可能是胰蛋白酶將具有DPPH自由基清除能力的活性肽段水解為更小的肽段或者氨基酸，從而使得消化后DPPH自由基清除能力極大降低。Yang等[9]研究了不同濃度的醬油糟蛋白水解物的DPPH自由基清除能力，結果表明醬油糟蛋白水解物的DPPH自由基清除率均呈劑量依賴性，與本試驗變化規律一致。李茹等[19]的研究表明新鮮蘿卜苗酶解后DPPH自由基清除率有所降低，與本試驗乳清肽經模擬胰液消化后的變化相似。

2.5 消化前后乳清肽的ABTS＋自由基清除能力

消化前后乳清肽的ABTS＋自由基清除能力結果見圖4。

圖4 不同處理的乳清肽的ABTS+自由基清除能力Fig.4 ABTS+free radical scavenging capacity of whey peptides treated with different treatments

如圖4所示，經模擬胃腸液消化以后，乳清肽的ABTS＋自由基清除能力都有一定程度的提高（p＞0.05）。造成這一現象的可能原因是經模擬胃腸液消化以后，乳清肽中部分大分子質量肽段被水解為具有ABTS＋自由基清除活性的小肽段，增強了乳清肽的ABTS＋自由基清除能力。毛小雨[21]研究得到蕓豆蛋白在經模擬胃腸消化后其消化產物的ABTS＋自由基清除能力較消化前均有所提高，與本試驗研究結果一致。

2.6 消化前后乳清肽的鐵離子還原能力

消化前后乳清肽的鐵離子還原能力結果見表3。

表3 不同處理的乳清肽的FRAP值Table 3 FRAP values of whey peptides treated with different treatments

由表3可知，乳清肽經模擬胃腸液消化以后，其FRAP值都得到了不同程度的提升，這與其ABTS＋自由基清除能力變化趨勢一致，結合分子質量分布結果可知，經模擬胃腸液消化以后乳清肽中分子質量150 Da～1 000 Da的組分均有所增加。研究表明，與高分子質量肽相比，低分子質量肽具有更好的還原能力，從而使得消化后乳清肽FRAP值有所增加[22]。張文敏等[23]通過酶解制備亞麻籽粕的酶解物也有相同的發現，即分子質量較低的亞麻籽粕肽具有較高的FRAP值。

2.7 消化前后乳清肽的氧自由基吸收能力

消化前后乳清肽的氧自由基吸收能力結果見圖5。

圖5 不同處理的乳清肽的ORAC值Fig.5 ORAC values of whey peptides treated with different treatments

如圖5所示，與未消化組相比，模擬胃液組的ORAC值顯著提高（p＜0.05），模擬胰液組的ORAC值極顯著提高（p＜0.01）。CHO[24]研究了米糠蛋白分離物在模擬胃腸消化過程中抗氧化性能的變化，其中ORAC值在模擬胃腸消化后得到了顯著提高，與本試驗乳清肽ORAC值的變化規律一致。造成這種現象的原因可能是酶解使得具有抗氧化活性的氨基酸或短肽暴露出來，具有抗氧化活性的物質有效地阻止了自由基連鎖反應，從而使得酶解后乳清肽ORAC值極大提高[25]。

3 結論

本研究以乳清蛋白為原料，在前期酶解工藝的基礎上制備得到了乳清肽。通過使用高效凝膠過濾色譜法，測定經模擬胃腸液消化以后乳清肽的分子質量分布變化，結果表明乳清肽在消化后分子質量范圍在150 Da～1 000 Da的組分含量均有所增加，重均分子質量下降，但下降輻度不超過16.26%；經紫外全波長掃描后，4組乳清肽溶液中280 nm處均有一個不明顯的吸收峰，且模擬胃液組和模擬胰液組的乳清肽吸收峰高于未消化組，其可能的原因是乳清肽經模擬胃腸液消化以后色氨酸與酪氨酸的芳香雜環組成發生了變化；圓二色光譜結果表明了乳清肽中α-螺旋在經模擬胃腸液消化后雖有所增加，但總量較少，而無規則卷曲占所有二級結構總量的約1/3，表征了乳清肽的結構無序性高且比較松散。ABTS＋自由基清除率、FRAP值及ORAC值經模擬胃腸液消化以后，均有所升高，ORAC值經模擬胃腸液消化以后提高顯著；DPPH自由基清除率經模擬胰液消化后有所降低，從40%～80%范圍降到了20%～30%，但仍具備一定的DPPH自由基清除活性。綜上，乳清肽在結構和抗氧化活性方面均具有一定的抗消化穩定性，且整體上抗氧化活性在消化后有所增強，這為乳清肽在抗氧化食品及相關食品添加劑的應用方面提供了一定的理論基礎。