線葉金雀花色素的超聲輔助提取工藝研究

丁建英，朱穎越，毛廣進，周謹文，薛靜文，晏婧怡

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

線葉金雀花是產于南非的一種開花灌木植物，其作為茶或藥用在國外已有300多年的歷史，2014年我國衛計委將其列為新食品原料[1]。因其制作的茶味道甜美、氣味芬芳，不含咖啡因，鞣質少，具有較強的抗氧化性能，是一種草本植物飲品[2]。線葉金雀花的研究主要集中在抗炎[3]、緩解皮膚干燥[4]、降血糖[5]、抗疲勞[6]、抗癌癥[7]等藥理作用和含有的多酚類物質[8-9]等化學成分的研究，作為新食品原料的線葉金雀花與其他不少植物相似，同樣含有豐富的天然色素，與合成色素相比，安全性較高，且具有一定的營養價值和藥理作用，但目前對線葉金雀花色素的提取研究鮮見報道。

色素常用的提取方法有浸提法、堿法、超聲波法、酶法等。浸提法[10-11]浸提時間長、效率低、分離效果不好。堿法[12]操作簡便，但會產生大量腐蝕性較強的廢液，對環境帶來了較大的負面影響。酶法提取主要采用酶破壞細胞壁結構使色素釋放，提取效率較高，但酶法提取后尚需后處理步驟[13]。同其他提取法相比，利用超聲波技術在提取過程中產生的強烈振蕩、空化作用等機械效應能使溶劑有效滲入植物細胞壁[14]中，可有效提高提取分離率，縮短提取時間、節約成本、甚至還可以提高產品的質量和產量[15-16]。本文使用超聲輔助提取方法，探索線葉金雀花色素的最佳提取工藝參數，為線葉金雀花中色素的提取及應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

線葉金雀花：Carmien公司（南非）；無水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為蒸餾水。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；UV1700PC紫外可見分光光度計：南京科捷分析儀器有限公司；超聲波清洗器：寧波雙嘉儀器有限公司；XL-10B中藥微型粉碎機：廣州市旭朗機械設備有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機：上海浦東光學儀器廠；JA103PL電子天平：上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料處理

將線葉金雀花清洗后，置于60℃烘箱烘干，粉碎過40目篩后4℃保存備用。

1.2.2 線葉金雀花色素提取工藝

0.5 g線葉金雀花粉末加入乙醇溶液混勻→設置相應的超聲溫度和超聲時間→提取液8 000 r/min離心10 min→過濾后得到線葉金雀花色素提取液。

1.2.3 線葉金雀花色素最大吸收波長的測定

在三角瓶中放入0.5 g線葉金雀花粉末按照料液比1∶50（g/mL），以50%乙醇溶液作為提取劑，設置提取溫度40℃、超聲時間30 min，然后將提取液以8 000 r/min離心10 min，過濾后，取0.5 mL置于50 mL容量瓶中，定容后，用紫外可見分光光度計在250 nm～800 nm的范圍內進行，得到光譜曲線，確定線葉金雀花色素的最大吸收波長。

1.2.4 線葉金雀花色素提取單因素試驗

通過測定并比較色素提取液吸光度大小，研究不同料液比[1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL）]、提取溫度（30、40、50、60、70℃）、提取時間（20、30、40、50、60 min）、提取液乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%）對線葉金雀花色素提取量的影響。

1.2.5 響應面法優化線葉金雀花色素提取工藝

使用Design-Expert軟件根據單因素試驗所獲得的結果設計響應面模型[17-18]，在提取溫度為60℃的條件下，以線葉金雀花色素的吸光度值為響應指標，設計三因素（提取時間、乙醇濃度、料液比）的響應面模型，對響應面模型得到的結果進行分析，研究超聲時間、乙醇濃度以及料液比對線葉金雀花色素吸光度的影響。響應面因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of the response surface analysis

2 結果與分析

2.1 線葉金雀花色素吸收光譜特征

線葉金雀花色素吸收光譜特征見圖1。

圖1 線葉金雀花色素吸收光譜特征Fig.1 Absorption spectral characteristics of pigment from rooibos

如圖1所示，在250 nm～800 nm范圍內，線葉金雀花色素在280 nm和320 nm處有明顯的吸收峰，最大吸收峰為280 nm。因此選取280 nm作為測定線葉金雀花色素溶液吸光度的特定波長。

2.2 單因素試驗的數據分析

2.2.1 提取時間對線葉金雀花色素提取效果的影響

提取時間對線葉金雀花色素提取效果的影響見圖2。

圖2 提取時間對線葉金雀花色素提取效果的影響Fig.2 The effect of extraction time on the pigment from rooibos

如圖2所示，超聲提取時間在20 min～40 min范圍內，線葉金雀花色素的吸光度值隨著超聲提取時間的延長而增加，超聲時間超過40 min后，線葉金雀花色素的吸光度值不僅沒增加反而減小，這可能是因為線葉金雀花粉末與乙醇充分接觸，傳質達到飽和[19]，線葉金雀花色素已充分溶出，繼續延長時間，在超聲波作用下，部分色素遭到破壞[20]，從而使提取液的吸光度值下降，因此，本研究把提取時間30 min～50 min作為響應面法的考察范圍。

2.2.2 乙醇濃度對線葉金雀花色素提取效果的影響

乙醇濃度對線葉金雀花色素提取效果的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對線葉金雀花色素提取效果的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on pigment from rooibos

如圖3所示，乙醇濃度在30%～50%范圍內，線葉金雀花色素的吸光度伴隨著乙醇濃度的增大而增大，這可能是由于隨著乙醇濃度的增加，使色素加速溶解在提取劑中，導致吸光度值增加。乙醇濃度超過50%之后，線葉金雀花色素的吸光度值逐漸減小，這可能是由于隨著乙醇濃度的繼續增加，導致溶劑極性降低，進而降低水溶性色素的溶出，吸光度值降低[21]。本研究把提取液的乙醇濃度40%～60%作為響應面法的考察范圍。。

2.2.3 提取溫度對線葉金雀花色素提取效果的影響

提取溫度對線葉金雀花色素提取效果的影響見圖4。

圖4 提取溫度對線葉金雀花色素提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on pigment from rooibos

如圖4所示，提取溫度在30℃～60℃范圍內，線葉金雀花色素的吸光度值伴隨著提取溫度的升高而逐漸增大，這是由于提取溫度升高，加速了分子間的熱運動，使色素分子加速溶出[22]，溶液中色素的含量增加，所以線葉金雀花色素溶液的吸光度變大。當提取溫度超過60℃后，提取的色素溶液的吸光度有所下降，這可能溫度過高，部分色素被破壞，所以本研究將線葉金雀花色素的提取溫度設為60℃。

2.2.4 料液比對線葉金雀花色素提取效果的影響

料液比對線葉金雀花色素提取效果的影響見圖5。

圖5 料液比對線葉金雀花色素提取效果的影響Fig.5 Effect of ratio of material to liquid on pigment from rooibos

如圖 5 所示，在 1∶40（g/mL）到 1∶80（g/mL）范圍內，隨著提取溶劑的增加，線葉金雀花色素的吸光度值呈先增大后減小的趨勢，這可能是由于料液比的增大使色素分子與溶劑的接觸面積變大，色素分子在溶劑中溶解增加，所以吸光度值增大[23]。但當料液比增大至1∶50（g/mL）以后，由于溶劑將色素相對稀釋，使提取液的吸光度值減小。料液比過大也會增加濃縮的成本[24]，因此綜合考慮及提取效率，本研究將料液比設定為1∶40（g/mL）～1∶60（g/mL）作為響應面法的考察范圍。

2.3 響應面優化結果分析

2.3.1 響應面優化設計及結果

利用Design-Expert軟件，在提取溫度為60℃條件下，設計三因素（提取時間、乙醇濃度、料液比）的17次試驗（中心點試驗要重復5次），將線葉金雀花色素的吸光度作為響應指標，來優化線葉金雀花色素的提取工藝，模型設計及結果見表2，回歸方差分析見表3。

表2 線葉金雀花色素的響應面試驗設計及結果Table 2 Test design and the results of response surface of pigment from rooibos

2.3.2 模型建立及顯著性分析

利用Design-Expert軟件對響應面模型進行ANOVA處理，得到回歸方差分析表以及得到了提取線葉金雀花色素的二次模型方程：吸光度=0.82＋3.000×10-3A＋0.013B-0.048C＋0.029AB＋3.75×10-3AC＋0.02BC-0.016A2-0.031B2-0.032C2。由表3可以看出此模型的顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05），決定系數為R2為0.970 1，信噪比為15.151，說明該模型試驗結果可信度高，可以用來對線葉金雀花色素的提取工藝條件的預測。其中，A、B、C 3個因素，因素A不顯著（P＞0.05），因素 B 和 C 顯著（P＜0.05），二次項 A2、B2、C2均顯著（P＜0.05）。根據表3可以看出，3個因素影響大小依次為C料液比＞B乙醇濃度＞A提取時間。其中料液比對線葉金雀花色素的提取影響最大（P＜0.000 1）。

表3 回歸方差分析表Table 3 Regression simulation analysis of variance

在提取溫度為60℃時，根據響應面優化選擇線葉金雀花色素的最佳提取條件為超聲提取時間39.56min、乙醇濃度 49.5%、料液比 1∶42.35（g/mL），理論預測的吸光度值為0.836。

2.3.3 響應面結果分析

利用Design-expert軟件通過響應面優化結果，得到A提取時間、B乙醇濃度、C料液比這3個因素之間的交互作用對線葉金雀花色素吸光度的影響大小的3D面線圖以及等高線圖如圖6所示。

分析響應曲面圖和等高線可以說明各因素對響應值的貢獻，等高線的形狀也可直觀看出交互效應的大小，等高線為橢圓形時，說明兩因素的交互作用較強[25]。

由圖6a、b、e、f所示，圖形明顯呈現為橢圓，說明A提取時間和B乙醇濃度兩個因素及B乙醇濃度和C料液比交互作用顯著，料液比和提取時間的交互作用不顯著。沿著A提取時間向峰值方向的等高線密度比沿著B乙醇濃度向峰值方向的等高線密度低，說明B乙醇濃度對線葉金雀花色素的吸光度值大小影響更大。當料液比為1∶50（g/mL）時，B乙醇濃度在40%～60%范圍內和A超聲時間在30 min～50 min范圍內時，隨著乙醇濃度的增加，線葉金雀花色素的吸光度值大小先增大后減小。沿著B乙醇濃度向峰值方向的等高線密度比沿著C料液比向峰值方向的等高線密度低，說明C料液比對線葉金雀花色素的吸光度值影響更大。當提取時間為40 min時，B乙醇濃度在40%～60%范圍內和 C 料液比在 1∶40（g/mL）～1∶60（g/mL）范圍內時，隨著乙醇濃度的增大，線葉金雀花色素的吸光度值先增大后減小。

圖6 各種因素對線葉金雀花色素提取效果的交互作用及其響應面圖Fig.6 Interaction of various factors on pigment from rooibos and its response surface diagram

2.4 最佳工藝驗證試驗

在驗證試驗中，將線葉金雀花色素提取條件設置為提取溫度60℃，乙醇濃度50%，提取時間40 min，料液比1∶40（g/mL），進行3次平行試驗測得線葉金雀花色素的平均吸光度值為0.824，與理論預測值相接近。

3 結論

本研究通過響應面試驗確定超聲提取線葉金雀花色素的最佳工藝條件：提取溫度為60℃，乙醇濃度設定為 50%，提取時間為 40 min，料液比為 1∶40（g/mL），在此條件下，提取液中線葉金雀花色素的吸光度值為0.824。3個因素對色素提取的影響大小依次為料液比＞乙醇濃度＞提取時間。下一步應對線葉金雀花色素的成分進行進一步分析研究，為今后更好地利用線葉金雀花資源提供理論依據。