乳清蛋白肽美拉德反應產物的優化制備及其抗氧化活性

蔡惠鈿，謝妍純，張逸

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.華農（潮州）食品研究院有限公司，廣東 潮州 521000）

美拉德反應是氨基化合物與還原糖（羰基化合物）之間發生的非酶褐變反應，在該反應過程中無需任何催化劑，美拉德反應僅通過加熱的方式就能自發進行[1-2]。隨著反應的進行會產生一系列復雜的產物，如還原酮、類黑精、含氮、含硫等揮發性雜環化合物[3]。大量研究已經證實美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs）中的反應初期產物具有較強的抗氧化活性，通常作為天然抗氧化劑加入到食品中，以提高食品的抗氧化活性[4]。蛋白質在水解酶作用下會產生抗氧化肽，抗氧化肽也可以與還原糖發生美拉德反應，所得產物的抗氧化活性顯著增強[5]。近年來，研究表明MRPs能有效提高天然蛋白質、肽及氨基酸的抗氧化活性，同時具有天然抗氧化劑高效、低毒和無污染的優點[6]。林巍等[7]研究糖對紫花蕓豆肽美拉德反應產物的抗氧化活性的影響，研究發現美拉德反應產物的抗氧化活性顯著高于紫花蕓豆肽。Vhangani等[8]研究水性核糖-賴氨酸和果糖-賴氨酸體系，發現水性核糖和果糖與賴氨酸發生美拉德反應所得產物的抗氧化活性均顯著高于賴氨酸。Huang等[9]探究了葡萄糖-甘氨酸、葡萄糖-二甘氨酸和葡萄糖-三甘氨酸3種體系發生美拉德反應產物的抗氧化活性，結果發現MRPs對ABTS+自由基和DPPH自由基清除率以及鐵還原力顯著高于3種氨基酸，同時葡萄糖-二甘氨酸體系所得的MRPs抗氧化活性最強。閆芳等[10]研究了殼聚糖與賴氨酸發生美拉德反應，測定MRPs、殼聚糖和賴氨酸的抗氧化活性，研究發現MRPs抗氧化活性顯著高于殼聚糖和賴氨酸，結果表明美拉德反應能顯著提高物質的抗氧化活性。王文瓊等[11]研究發現乳清蛋白與葡萄糖、乳糖、木糖、麥芽糖和果糖5種糖的復合產物都能有效清除DPPH自由基，同時具有較高的還原能力。張曦等[12]研究發現乳清蛋白-木糖發生美拉德反應，其產物包裹在核桃仁上能有效抑制核桃仁酸價的升高，但單獨使用乳清蛋白膜對核桃仁酸價升高無顯著的抑制作用。

目前，國內外研究主要集中在美拉德乳清蛋白復合物的制備及抗氧化活性等方面，而對于采用乳清蛋白水解物進行美拉德反應，研究乳清蛋白水解物與還原糖發生美拉德反應制備其產物及其抗氧化活性的報道較少。前期研究發現乳清蛋白在堿性蛋白水解酶的作用下，所得的水解物具有較強的抗氧化活性。以此為依據，本研究以乳清蛋白堿性蛋白酶水解物為原料與葡萄糖發生美拉德反應，制備乳清蛋白肽美拉德反應產物（whey protein peptides Maillard reaction products，WPP-MRPs），探究其制備工藝，同時探究不同濃度WPP-MRPs對ABTS+自由基和羥基自由基清除能力，為WPP-MRPs作為天然抗氧化劑在功能性食品中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清蛋白：南京帕爾斯生物科技有限公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g，分子質量約為27 300 D）：上海金穗生物科技有限公司；ABTS：美國Sigma公司；鐵氰化鉀（分析純）、三氯乙酸（分析純）、氯化鐵（分析純）：上海金錦樂實業有限公司；乙醇（分析純）：湖北威德利化學科技有限公司；水楊酸（分析純）、過氧化氫（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；過硫酸鉀（分析純）、乙酸鈉（分析純）：溫州市金海化學品市場有限公司；磷酸鹽緩沖液（分析純）：上海盛思生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

U-T6紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；ZA120.4電子天平：上海贊維衡器有限公司；HHW420電熱恒溫水浴鍋：濟南歐萊博科學儀器有限公司；XD-52AA旋轉蒸發儀：上海賢德實驗儀器有限公司；KH20R-Ⅱ臺式高速冷凍離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；FD-2D-80壓蓋掛瓶型真空冷凍干燥機：上海繼譜電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPP-MRPs的制備

參考Peng等[13]的方法，并稍作調整。準確稱取2.0 g乳清蛋白，配制成質量濃度為5%的乳清蛋白溶液，將其在95℃恒溫水浴鍋中，保持5 min，隨后加入質量濃度1 mol/L的NaOH溶液，將溶液pH值調至8.5，然后按照酶與底物1∶50（體積比）的比例加入堿性蛋白酶（200 000 U/g），在55℃恒溫水浴鍋中振蕩水解，在水解過程中不斷向溶液中加入質量濃度1 mol/L的NaOH溶液，使溶液pH值保持在8.5，持續水解3 h，最后煮沸5 min，使堿性蛋白酶失活。待水解結束后，向其中加入一定比例的還原糖，保持一定的溫度，并不斷攪拌，反應一段時間后，立即用冰水混合物迅速將其進行降溫，終止反應，所得的樣品置于離心機中，離心15 min，除去沉淀，將得到的上清液進行減壓濃縮，最后置于真空冷凍干燥機中凍干，獲得WPP-MRPs。

1.3.2 還原糖種類的篩選

選擇葡萄糖、果糖、乳糖作為還原糖原料，分別加入到質量濃度為5%的乳清蛋白水解液中，確保3種糖的質量濃度為5%，溶液初始pH值為8.5，分別取10 mL的溶液于25 mL具塞玻璃管中，在80℃的恒溫水浴中反應 0、1、2、3、4、5 h，取樣后立即放入冰水浴中冷卻，最終獲得WPP-MRPs，在4℃冰箱中保存，用于測定其抗氧化活性（以還原力為考察指標），確定最佳的還原糖種類。

1.3.3 單因素試驗

將WPP-MRPs作為研究對象，考察葡萄糖濃度、反應溫度、反應時間和pH值對WPP-MRPs的抗氧化活性（以還原力為考察指標）的影響。在預試驗的基礎上，設定葡萄糖濃度5%、6%、7%、8%、9%5個水平；反應溫度 50、60、70、80、90 ℃ 5 個水平；反應時間 1、2、3、4、5 h 5 個水平；pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 5 個水平。每組試驗重復3次。

1.3.4 響應面法試驗

在單因素試驗的基礎上，以葡萄糖濃度（X1）、反應溫度（X2）、反應時間（X3）和 pH 值（X4）為自變量，以還原力（Y）為響應值。根據Box-Behnken試驗設計，優化出制備WPP-MRPs的工藝。因素與水平設計如表1所示。

表1 試驗設計因素與水平Table 1 Coded and actual value of factors and levels

采用響應面法（response surface methods，RSM）得到的二次回歸模型，其模型如下。

式中：b0為截距回歸系數；bi為線性回歸系數；bii為二次效應回歸系數；bij為交互項回歸系數；Xi、Xj為自變量。

1.3.5 遺傳算法設計

依據單因素試驗結果，選取葡萄糖濃度、反應溫度、反應時間和pH值4個因素為決策變量，如式（2）所示。

遺傳算法優化的約束條件：選擇各因素水平的上下限，WPP-MRPs的還原力最優的約束條件如式（5）所示。

1.3.6 WPP-MRPs的超濾分級純化

利用中空纖維超濾膜將1.3.1中制備的WPP-MRPs混合物上清液（最優制備工藝下）進行超濾分級。當溫度在20℃和壓力在0.1 MPa條件下，將WPP-MRPs先后通過5 kDa和0.8 kDa的超濾膜進行截流分段，將分子量＜0.8 kDa、0.8 kDa＜分子量＜5 kDa、分子量＞5 kDa分別記為組分Ⅰ、組分Ⅱ和組分Ⅲ，將得到的3種組分首先利用旋轉蒸發濃縮，然后利用真空冷凍干燥機將其凍干，備用。

1.3.7 抗氧化活性的測定

1.3.7.1 還原力的測定

參照Canabady-Rochelle等[14]的方法并略作改動。分別將WPP-MRPs和組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別配制成質量濃度為 10、20、30、40、50、60、70 mg/mL 的樣品溶液，分別從中取出0.5 mL置于20 mL具塞玻璃管中，然后分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）和2.5 mL鐵氰化鉀（1%）溶液，充分混合，將其置于50℃恒溫水浴鍋中保持20 min后，立即用冰水浴將其冷卻，隨后加入2.5 mL三氯乙酸（10%）溶液，然后以7 000 r/min離心15 min，取2.5 mL上清液，再加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL氯化鐵（0.1%）溶液，充分混合，靜置10 min，最后在700 nm波長處測定樣品的吸光度。

1.3.7.2 ABTS＋自由基清除能力的測定

參照Huang等[15]的方法并略作改動。分別將WPPMRPs和組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別配制成質量濃度為10、20、30、40、50、60、70 mg/mL 的樣品溶液。將質量濃度為7.0 mmol/L ABTS溶液與終濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀充分混合，在25℃條件下，避光靜置12 h。利用pH值為4.5的乙酸鈉溶液稀釋至波長734 nm處的吸光度為0.7±0.02。取3 mL溶液與20 μL樣品溶液混合，靜置6 min，在波長734 nm處測定每個樣品的吸光度，以不加樣品液為對照，依據式（6）計算ABTS＋自由基清除率。

式中：Ac為對照品的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.3.7.3 羥基自由基清除能力的測定

參照Li等[16]的方法并略作改動。分別將WPP-MRPs和組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別配制成質量濃度為10、20、30、40、50、60、70 mg/mL的樣品溶液。分別取1 mL不同濃度的樣品溶液于20 mL具塞玻璃瓶中，依次加入1 mL質量濃度為7.0 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL質量濃度為6.0 mmol/L的H2O2溶液，混合均勻，靜置10 min，然后再加入1 mL質量濃度為6.0 mmol/L的水楊酸溶液，充分混合，靜置30 min后，在波長510 nm處測定每個樣品的吸光度。以乙醇溶液代替待測液作空白，測定吸光度，以不加樣品液為對照，依據式（7）計算羥基自由基清除率。

式中：A0為無水楊酸時樣品液的吸光度；A1為對照品的吸光度；A為空白對照的吸光度。

1.4 數據處理

每組試驗重復3次，結果用平均值±標準偏差；采用Statistics 8.0軟件對試驗數據進行顯著性分析；采用Design-Expertver 8.0軟件設計Box-Behnken組合試驗；采用Matlab R2018b軟件優化WPP-MRPs的制備工藝；采用Origin9.0軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 還原糖種類的確定

還原法常用于判斷物質是否具有抗氧化活性，其機理是待測物質如果能提供電子和質子氫，達到清除過量自由基的目的，從而表現出較好的抗氧化活性[17]。故本研究可利用該原理判斷美拉德產物是否具有抗氧化活性，即還原能力越強，抗氧化活性越顯著。本試驗分別選取葡萄糖、乳糖、果糖與乳清蛋白肽進行美拉德反應，反應條件設定如下：反應溫度80℃，還原糖濃度為7%，反應時間0～5 h，以WPP-MRPs還原力為指標，其結果如圖1所示。

由圖1可知，當反應時間在0～3 h內，隨反應時間的延長，葡萄糖與乳清蛋白肽反應生成的WPP-MRPs的還原力顯著增加（P＜0.05），當反應時間超過3 h，隨反應時間的延長WPP-MRPs還原力無顯著變化（P＞0.05）。當反應時間在0～5 h內，乳糖、果糖與乳清蛋白肽反應生成的WPP-MRPs的還原力隨反應時間的延長而顯著增加（P＜0.05），呈時間依賴性。將葡萄糖、乳糖、果糖與乳清蛋白肽反應生成WPP-MRPs，對比產物的還原力，經對比發現，葡萄糖與乳清蛋白肽反應生成的WPP-MRPs的還原力顯著高于乳糖、果糖與乳清蛋白肽反應生成WPP-MRPs。其原因是由于葡萄糖碳鏈較短，更易于蛋白質反應，從而改變蛋白質原有的生理特性[7]。Dong等[18]和Gu等[19]分別在研究葡萄糖與β-乳球蛋白和酷蛋白進行美拉德反應產物的還原能力也有類似的結果。

圖1 還原糖種類對WPP-MRPs還原力的影響Fig.1 Effect of types of reducing sugar on reducing power of WPP-MRPs

2.2 單因素對WPP-MRPs還原力的影響

單因素對WPP-MRPs還原力的影響，其結果如圖2所示。

由圖2A可知，當葡萄糖濃度在5%～7%范圍內，隨葡萄糖濃度增加WPP-MRPs還原力顯著增加（P＜0.05）。其原因是隨葡萄糖濃度增加，葡萄糖更易于乳清蛋白肽發生美拉德反應，生成WPP-MRPs還原力更強[20]。但當葡萄糖濃度超過7%時，繼續增加葡萄糖濃度WPP-MRPs還原力無顯著變化（P＞0.05）。該研究結果與孫常雁等[21]探究乳清蛋白肽美拉德反應產物的抗氧化活性有相似的結果。綜上，選擇葡萄糖濃度范圍為7%～9%進行后續的組合試驗。

圖2 不同試驗因素對WPP-MRPs還原力的影響Fig.2 Effect of different experimental factors on the reductive power of WPP-MRPs

由圖2B可知，當反應溫度在50℃～80℃范圍內，WPP-MRPs還原力隨反應溫度升高呈顯著增加的趨勢（P＜0.05），反應溫度在 80℃時，WPP-MRPs還原力取得最大值0.82±0.03。其原因是隨反應溫度的升高，促進美拉德反應，可在較短時間內生成更多的產物（還原酮和雜環化合物等），產物具有較強的抗氧化活性，進而提高WPP-MRPs還原力[10]。但當反應溫度超過80℃時，WPP-MRPs還原力隨反應溫度升高而顯著降低（P＜0.05）。這歸因于美拉德反應產物不穩定，在較高的溫度下易分解，從而失去原有的抗氧化活性[22]。故反應溫度選擇70、80、90℃這3個水平進行后續組合試驗。

由圖2C可知，當反應時間在3 h內，隨反應時間延長WPP-MRPs還原力顯著增加（P＜0.05），反應時間在3 h時，WPP-MRPs還原力取得最大值0.86±0.02。這是由于隨反應時間延長，美拉德反應更加充分，美拉德反應中間產物經脫氫、縮合及分子重排最終形成類黑精以及揮發性的雜環化合物，從而使WPP-MRPs還原力顯著增加[23]。但當反應時間超過3 h，繼續延長反應時間，會導致產物分解，造成WPP-MRPs還原力降低。綜上，反應時間選擇2、3、4 h這3個水平進行后續組合試驗。

由圖2D可知，當pH值在7.0～8.5范圍內，WPPMRPs還原力隨pH值增加呈顯著增加的趨勢（P＜0.05），pH值在8.5時，WPP-MRPs還原力取得最大值（0.87±0.04）。Lertittikul等[24]同樣發現 pH 值低于 8.5時，隨pH值增加美拉德反應越易進行，所得的產物抗氧化活性越強。當pH值過高，也不利于美拉德反應的進行，從而使得抗氧化活性降低。閆芳等[10]在探究殼寡糖-賴氨酸美拉德反應產物抗氧化特性時也有類似的結果。故pH值選擇8.0、8.5、9.0這3個水平進行后續組合試驗。

2.3 響應曲面法試驗結果

2.3.1 模型建立與顯著性檢驗

通過遺傳算法優化WPP-MRPs制備工藝，所得的試驗方案和結果見表2。

表2 響應曲面法試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

續表2 響應曲面法試驗設計及結果Continue table 2 Experimental design and results of response surface methodology

以WPP-MRPs的還原力（Y）為響應值，對試驗所得的數據進行多元回歸擬合分析，得到WPP-MRPs的還原力對葡萄糖濃度（X1）、反應溫度（X2）、反應時間（X3）和 pH 值（X4）的回歸模型如式（8）所示。

對回歸方程系數進行顯著性檢驗，結果如表3所示。

由表3可知，數學模型決定系數R2=0.849 6，F=5.65，P＜0.01，結果表明通過RSM建立的數學模型極顯著。該模型失擬項P=0.086 4＞0.05，表明模型失擬項不顯著。通過以上數據分析表明通過RSM所建立的數學模型對試驗數據擬合充分，可靠性較好。

利用F值大小可以判斷試驗因素對響應值的影響程度，F值越大，說明該因素對響應值的影響越顯著。由表 3 知，F（X1）=15.50、F（X2）=5.90、F（X3）=0.21 和F（X4）=7.64，即各試驗因素對 WPP-MRPs的還原力的影響順序為葡萄糖濃度（X1）＞pH值（X4）＞反應溫度（X2）＞反應時間（X3），且葡萄糖濃度對 WPP-MRPs的還原力的影響達到極顯著水平。

表3 WPP-MRPs制備工藝回歸模型系數的顯著性檢驗報告Table 3 Significance test report of regression model coefficients of WPP-MRPs preparation process

利用等高線圖形來判斷因素交互作用對響應值的影響程度是否顯著。當等高線圖形為橢圓時，代表因素交互作用顯著影響響應值變化；當等高線圖形為圓形時，代表因素交互作用對響應值變化無顯著影響[25]。圖3反映各試驗因素交互作用對WPP-MRPs的還原力的影響。

由表3方差分析結果可知，X1X2、X1X3和X1X4的交互作用均對WPP-MRPs的還原力無顯著影響（P＞0.05），故在此不做分析。X2X3和X2X4的交互作用均能顯著影響WPP-MRPs的還原力（P＜0.05）。由圖3A和3C可知，WPP-MRPs的還原力均存在極值點。圖3B和3D的等高線圖均呈橢圓型，表明X2X3和X2X4的交互作用顯著影響WPP-MRPs的還原力。綜上可知，對WPP-MRPs的還原力影響因素順序為葡萄糖濃度（X1）＞pH 值（X4）＞反應溫度（X2）＞反應時間（X3），該結果也與方差分析的結果一致。

圖3 各試驗因素交互作用的響應面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

2.3.2 WPP-MRPs制備的工藝參數優化

利用Matlab R2018b軟件中的遺傳算法優化工具箱進行分析優化，迭代128次，WPP-MRPs的還原力取得最大值，此時葡萄糖濃度（X1）、反應溫度（X2）、反應時間（X3）和 pH 值（X4）水平編碼分別為 0.296、1、1、1，即試驗水平分別為8.296%、90℃、4 h和9.0，在此條件下，所得WPP-MRPs還原力理論值為0.97。遺傳算法M文件運行結果如圖4所示。

圖4 遺傳算法優化結果Fig.4 The results optimized by the genetic algorithm

2.3.3 試驗驗證

采用遺傳算法優化WPP-MRPs的制備工藝參數為：葡萄糖濃度8.296%、反應溫度90℃、反應時間4 h和pH9.0，WPP-MRPs的還原力的理論值0.97。為驗證遺傳算法的可靠性，結合實際情況，將上述工藝參數修正為葡萄糖濃度8.3%、反應溫度90℃、反應時間4 h和pH9.0，在此條件下WPP-MRPs的還原力的試驗值0.93±0.02，試驗值和理論值的相對誤差為4.36%。說明遺傳算法可較好地模擬和預測WPP-MRPs的還原力，進一步證明采用遺傳算法優化WPP-MRPs的制備工藝參數是可行的。

2.4 抗氧化結果

2.4.1 ABTS＋自由基清除能力的結果分析

ABTS經過氧化劑氧化后生成性質穩定的藍綠色ABTS＋自由基，向ABTS＋自由基加入抗氧化劑時，抗氧化劑與ABTS＋自由基發生反應，會使藍綠色褪色或消失[26]。抗氧化劑的抗氧化活性越強，提供電子的能力越強，ABTS＋自由基清除能力越強。因此，通過測定反應液吸光度的變化，可以反映樣品的抗氧化能力的強弱。WPP-MRPs、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對ABTS＋自由基清除能力結果如圖5所示。

由圖5可知，隨WPP-MRPs、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ質量濃度的增加ABTS＋自由基清除率顯著增加（P＜0.05），呈濃度依賴性。對數據進行回歸分析可知WPP-MRPs、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對ABTS＋自由基清除率的IC50分別為（47.15 ±0.83）、（56.86 ±1.15）、（39.92 ±0.72）、（57.37 ±1.11）mg/mL。IC50越小，說明物質的抗氧化活性越強，對比WPP-MRPs、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的IC50值可知，組分Ⅱ抗氧化活性最強，組分Ⅰ和組Ⅲ無顯著差異。Nienaber等[27]研究發現美拉德反應產物中中低分子量的產物抗氧化活性最強。該結果與本試驗結果一致。結果表明WPP-MRPs具有較強的抗氧化能力，可作為理想的抗氧化劑用于功能性食品中。

圖5 WPP-MRPs、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對ABTS+自由基清除能力的影響Fig.5 Effect of WPP-MRPs，components I，II and III on ABTS+radical scavenging capacity

2.4.2 羥基自由基清除能力的結果分析

羥基自由基屬于活性較強的自由基，幾乎可以與細胞內的所有有機物發生反應，造成DNA和細胞膜損傷、多糖解聚和不飽和脂肪酸發生過氧化、多種酶失活等變化，進而損傷細胞和機體的生理功能[28]。因此，羥基自由基的清除能力作為抗氧化活性評價中最主要的指標。WPP-MRPs、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對羥基自由基清除能力結果如圖6所示。

圖6 WPP-MRPs、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對羥基自由基清除能力的影響Fig.6 Effect of WPP-MRPs，components I，II and III on hydroxyl radical scavenging capacity

由圖6可知，羥基自由基清除率隨WPP-MRPs、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ質量濃度的增加而顯著增加（P＜0.05），且呈濃度依賴性。其原因是WPP-MRPs、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中碳鏈上的氫原子能與羥基自由基發生反應生成水，而碳鏈上的碳原子具有電子可氧化羥基自由基使其分解，從而直接清除羥基自由基[20]。對數據進行回歸分析可知WPP-MRPs、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對羥基自由基清除率的 IC50分別為（44.28±0.95）、（53.72±1.04）、（37.64±0.54）、（58.59±1.36）mg/mL。對比 WPP-MRPs、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的IC50值可知，四者對羥基自由基清除能力的順序為組分Ⅱ＞WPP-MRPs＞組分Ⅰ＞組分Ⅲ。該研究結果與孫常雁等[21]研究乳清蛋白肽美拉德產物的抗氧化性結果一致。進一步表明WPP-MRPs具有較強的抗氧化能力。

3 結論

本研究通過遺傳算法優化WPP-MRPs制備工藝，得到最優工藝參數為：葡萄糖濃度8.3%、反應溫度90℃、反應時間4 h和pH9.0，在此條件下WPP-MRPs的還原力為0.93±0.02。在最優工藝條件下制備的WPPMRPs對ABTS＋自由基和羥基自由基清除率的IC50分別為（47.15±0.83）、（44.28±0.95）mg/mL。研究結果說明WPP-MRPs作為食品原料在功能性食品領域中應用具有廣闊的市場前景。