TPK3基因敲除對釀酒酵母耐受性的影響

劉凱毅，任劍星，張曉曉，董勝勝，董健

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種單細胞的真核微生物，其形態大多為橢圓形、球形、臘腸形以及卵圓形。釀酒酵母常用于制作面包及啤酒、白酒葡萄酒等產品。近年來，在工業產業的不斷發展的進程中，社會對可持續化綠色發展的要求隨之不斷增長，從而帶動了生物燃料的發展，因此社會對生物乙醇的需求不斷地上升。在酒精發酵生產的過程中，釀酒酵母發酵速度快，產酒精濃度高，因此，釀酒酵母作為一種工業生產微生物，在酒精發酵產業中具有廣泛的應用[1]。在釀酒酵母發酵生產乙醇的過程當中，由于發酵過程的動態變化，釀酒酵母暴露于多種脅迫因子中，例如高溫、乙醇、滲透壓、乙酸等，在脅迫環境中其生長代謝受到抑制[2]。在釀酒酵母中，第二信使環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）在代謝調控、應激抗性和細胞周期調控中起著重大的作用[3-7]。蛋白Gpa2和Ras2可以調控由CYR1編碼的腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，AC），從而催化 cAMP 的合成[8]。蛋白激酶A（PKA）為Ras-cAMP信號通路的下游主要靶標[9]，cAMP含量的增加，導致PKA的調節亞基與催化亞基解離，使得PKA催化亞基參與其下游轉錄因子的磷酸化過程，引起一系列的胞內反應。PKA會對其下游效應物產生磷酸化作用，通過這種磷酸化作用，對細胞生長代謝及其應激反應進行調控[10-11]。PKA的下游效應物主要有 Rap1、Hsf1、Adr1、Msn2/Msn4、Ssn2 等轉錄因子[12-13]?，F有研究表明，在釀酒酵母處于脅迫環境當中，通過信號轉導產生應答機制，以此對外界脅迫環境產生一定耐受性能。釀酒酵母蛋白激酶A（PKA）可反向調控其耐受性[14-19]，蛋白激酶A（PKA）是一種異源四聚體蛋白，在結構組成上，它包括由BCY1基因編碼的兩個調控亞基和由TPK1、TPK2、TPK3編碼的催化亞基[20]。因此在理論上通過弱化PKA活性，來提高釀酒酵母的耐受性。

本試驗利用基因工程手段重組菌株，即通過基因工程手段改造菌種，敲除編碼釀酒酵母蛋白激酶A催化亞基的TPK3基因，實現PKA活性的弱化，以此改善釀酒酵母對外界環境脅迫因子的耐受性能。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株、試劑、儀器

1.1.1 菌種

AY12a：天津科技大學生物工程學院現代釀造技術研究室；AY12a-2：本研究中AY12a的TPK3基因敲除菌株。

1.1.2 試劑

葡萄糖、氯化鈉（分析純）：天津索羅門生物科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉（生化試劑）：北京華威銳科化工有限公司；冰乙酸（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇（分析純）：天津聯星化工有限公司；乙酸鉀（生化試劑）：北京伊諾凱科技有限公司；rTaq DNA聚合酶（生化試劑）：TaKaRa公司。

1.1.3 儀器

HS-1300-V型超凈臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；AB204-S型分析天平：梅特勒-托利多儀器上海公司；TgL-16C臺式離心機：上海安亭科技儀器廠；BX43型生物顯微鏡：日本OLYMPUS會社；PowerPacTM型電泳儀、PCT-200聚合酶鏈式反應基因擴增儀：美國BIO-RAD公司；UVmini-1240紫外分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；Bioscreen C全自動生長曲線分析儀：芬蘭Oy Growth Curves Ab公司；IS-RDS3恒溫搖床：上海制成儀器制品有限公司。

1.1.4 主要培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：20 g/L 葡萄糖、20 g/L 蛋白胨、10 g/L酵母浸粉，加入蒸餾水定容，可加入20 g/L的瓊脂粉配制為固體YPD培養基，高壓滅菌鍋115℃滅菌20 min。

SD培養基：20 g/L葡萄糖、6.7 g/L無氨基酵母氮源、1.3 g/L尿嘧啶，加入蒸餾水定容，可加入20 g/L的瓊脂粉配制為固體YPD培養基，高壓滅菌鍋115℃滅菌20 min。

耐乙醇培養基：20g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母浸粉、20 g/L瓊脂粉，蒸餾水配制，pH值自然，115℃滅菌20 min，將其冷卻至35℃～40℃后加入10%的乙醇。

耐鹽培養基：80 g/L氯化鈉、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母浸粉、20 g/L瓊脂粉，加入蒸餾水定容，高壓滅菌鍋115℃滅菌20 min。

耐乙酸培養基：20g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母浸粉、20g/L瓊脂粉，加入蒸餾水定容，高壓滅菌鍋115℃滅菌20 min。將其冷卻至35℃～40℃加入0.4%的乙酸。

1.2 方法

1.2.1 菌株的構建

1.2.1.1 引物合成與設計

本試驗引物設計根據NCBI和Primer5.0，通過查詢NCBI得到TPK3基因組序列，再利用Primer5.0軟件設計出所需要的引物。具體引物序列見表1。

表1 試驗過程中使用的引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2.1.2 目的片段的擴增

將出發菌株AY12a的基因組為模板，使用引物對TPK3-U-F/TPK3-U-R和TPK3-D-F/TPK3-D-R，擴增TPK3（U）和 TPK3（D）上下同源臂，以及 TPK3-KanMX片段。從NCBI數據庫中查詢單端基因片段分別為626、686、1 645 bp。

1.2.1.3 突變株的獲得

通過 LiAc 轉化法[18，21]將目的片段 TPK3（U）、TPK3（D）、TPK3-KanMX導入釀酒酵母AY12a后，提取轉化子基因組為模板，并以出發菌株AY12a基因組為陰性對照，利用驗證引物Y-TPK3-U-F/Y-TPK3-U-R和Y-TPK3-D-F/Y-TPK3-D-R對轉化子通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）驗證。具體操作示意圖見圖1。

圖1 敲除TPK3基因的構建過程Fig.1 The construction process of knockout TPK3 gene

1.2.2 釀酒酵母細胞生長性能測定

本試驗通過生長曲線測定儀測量OD600值，以此確定釀酒酵母生長曲線，步驟如下所示。

1）取適量菌體接種至新鮮YPD液體培養基中，30℃、180 r/min于恒溫搖床中活化培養12 h。

2） 將活化后的菌液按照 0、2、4、6、8 μL 的梯度用移液槍按梯度打到100孔板里，并用YPD培養基補至200 μL。

3）將加有菌液的100孔板放置于生長曲線測定儀中，設置溫度為30℃，測定頻率為每30 min一次，總測定時間為24 h。

4）測定完成后，分析詳細數據，將橫坐標定為時間，縱坐標定為OD600值，以此作酵母生長曲線圖。

1.2.3 釀酒酵母細胞耐受性的測定

通過點板試驗測量酵母的耐受性[22]。首先將所測菌株的初始OD600調至一致，保證菌株初始濃度的一致性，然后將菌液以不同濃度梯度點板，每個梯度點2 μL的菌液到耐受性平板上，30℃培養1 d～2 d，觀察菌株生長情況，將出發菌株作參照對比組，對比判斷突變菌株對脅迫因子的耐受程度，以此分析突變菌株的相關耐受性。

1）耐熱擊性：將菌株于55℃下水浴處理4 min，將2 μL的熱擊處理菌液按不同濃度梯度吸取并點到YPD平板，30℃培養2 d～3 d，觀察平板上菌落生長情況，并以此分析菌株對高溫脅迫因子耐受性的變化。

2）耐乙醇性：將2 μL的菌液按不同濃度梯度吸取，并將其點到含有10%乙醇的耐乙醇培養基的平板上，30℃培養2 d～3 d，觀察平板上菌落生長情況，并以此分析菌株對乙醇脅迫因子耐受性的變化。

3）耐鹽性：將2 μL的菌液按不同濃度梯度吸取，并將其點到含有8%NaCl的耐鹽培養基的平板上，30℃培養2 d～3 d，觀察平板上菌落生長情況，并以此分析菌株對高滲高鹽脅迫因子耐受性的變化。

4）耐乙酸性：將2 μL的菌液按不同濃度梯度吸取，并將其點到含有0.4%乙酸的耐鹽培養基的平板上，30℃培養2 d～3 d，觀察平板上菌落生長情況，并以此分析菌株對乙酸脅迫因子耐受性的變化。

1.2.4 乙醇、葡萄糖含量測定

試驗選擇示差液相色譜儀測定酵母發酵完成后乙醇的產生量及葡萄糖的剩余量[23]，具體測定條件如下。

樣品預處理：發酵結束后，將發酵液在12 000 r/min條件下離心2 min，取上清液過膜加到液相小瓶。

色譜條件：使用Bio-Red的Aminex HPX-87H色譜柱，并將柱溫調至為60℃，進樣10 μL，流動相為0.6 mL/min過濾超聲的5 mmol/L的稀硫酸。

1.2.5 液體發酵工藝

為測定改造菌的發酵性能，采用液體發酵工藝，其主要操作步驟如下。

1.2.5.1 制備玉米水解液

取1 kg的玉米粒，加入3 L預熱到60℃～70℃的水，靜置20 min，糊化玉米粒，并使玉米顆粒充分吸水膨脹利于液化，加入0.6 mL液化酶（α-淀粉酶2×105U/mL），于85℃～90℃的水浴鍋中液化1.5 h，其間每30 min攪拌一次，從而提高液化效率，待液化結束后，靜置至55℃～60℃，再加入2 mL糖化酶（200 U/mL），進行糖化20 h，同樣進行攪拌。待玉米顆粒充分糖化結束后，將其過濾，分離玉米渣獲取玉米水解液，分裝，105℃高壓滅菌鍋滅菌20 min，冷卻至25℃左右，密封保存使用。

1.2.5.2 準備種子培養基

一級種子培養基：在糖度為8°Bé玉米水解液中加入0.5%的酵母浸粉，并于試管中分裝6 mL，然后利用高壓滅菌鍋105℃滅菌20 min，冷卻至25℃左右，接種菌體，30℃培養箱靜置培養24 h。

二級種子培養基：在糖度為12°Bé玉米水解液中加入0.5%的酵母浸粉，并于三角瓶分裝54 mL，然后利用高壓滅菌鍋105℃滅菌20 min，降至25℃左右，然后培育24 h的一級種子液全部加入準備好的分裝三角瓶中，30℃培養箱靜置培養16 h。

1.2.5.3 液體發酵

將玉米水解液的糖度調到20°Bé，于每個三角瓶分裝135 mL，于105℃下高壓滅菌20 min，降至25℃左右，將15 mL二級種子液接到其中，同時加入1 mL的營養鹽，30℃培養箱靜置發酵，每隔12 h稱重1次，記錄CO2失重量，當12 h的CO2失重量穩定在0.1 g左右時，將三角瓶轉移出培養箱，結束發酵過程。

2 結果與分析

2.1 獲得并驗證目的片段

將出發菌株AY12a的基因組作為目的基因片段的擴增模板，使用引物對TPK3-U-F/TPK3-U-R和TPK3-D-F/TPK3-D-R，擴增 TPK3（U）和 TPK3（D）上下同源臂，以及TPK3-KanMX片段。3段片段的長度分別為626、686、1 645 bp。利用瓊脂糖凝膠電泳檢驗片段的長度檢驗圖見圖2。

圖2 轉化所需片段Fig.2 The transformation of the fragments

2.2 突變株獲得的驗證

通過 LiAc轉化法將目的片段 TPK3（U）、TPK3（D）、TPK3-KanMX導入釀酒酵母AY12a后，提取轉化子基因組為模板，并以出發菌株AY12a基因組為對照，利用驗證引物Y-TPK3-U-F/Y-TPK3-U-R和YTPK3-D-F/Y-TPK3-D-R對轉化子通過PCR反應驗證。將PCR獲得的產物通過瓊脂糖凝膠電泳驗證，驗證圖見圖3。

圖3 轉化子的驗證Fig.3 The verification of transformants

由圖3顯示結果可知，條帶長度與NCBI數據庫一致，即完成重組菌株AY12a-2的構建。

2.3 突變株AY12a-2與出發菌株AY12a生長性能的比較

為檢驗突變株AY12a-2與出發菌株AY12a生長性能，采用1.2.2的方法，利用生長曲線測定儀，得到兩株菌株的生長曲線圖見圖4。

圖4 菌株的生長曲線Fig.4 Growth curve of strains

由圖4可知，在30℃的培養條件下為突變株AY12a-2與出發菌株AY12a的生長曲線接近一致，在第4小時達到對數中期，到12 h達到穩定期，兩株菌株在YPD中的生長性能接近相同，因此可進行下一步耐受性以及發酵性能的對比驗證。

2.4 突變株AY12a-2與出發菌株AY12a耐受性的比較

為比較突變株AY12a-2與出發菌株AY12a耐受性，本試驗按照方法1.2.3檢測了55℃高溫、10%高乙醇、8%高鹽、0.4%高乙酸這4種環境脅迫因子對菌株生長的影響，從而對突變株的相關耐受性進行分析，結果見圖5。

圖5 菌株的耐受性Fig.5 Stress tolerance of strains

由圖5可知，在沒有添加任何脅迫因子的YPD中，突變株AY12a-2與出發菌株AY12a的菌落情況基本保持一致，表明在點板試驗前這兩株菌的初始濃度一致。經歷55℃熱擊4min后，兩株菌株在YPD的生長有明顯區別，出發菌株在稀釋梯度（10-3）已經受到明顯抑制，與此同時重組菌株生長依舊良好，說明突變菌株耐熱擊性明顯優于出發菌株。在10%的乙醇耐性培養基上，突變菌株與出發菌株皆受到不同程度的影響，單突變菌株的菌落大小明顯大于出發菌株，由此可得突變菌株的耐乙醇性能略微提升。在0.4%的乙酸耐性培養基上，出發菌株在稀釋梯度（10-3）已經受到明顯抑制，與此同時重組菌株生長依舊良好，說明突變菌株耐乙酸性明顯優于出發菌株。在8%NaCl的耐鹽培養基上，出發菌株明顯受到抑制，而突變菌株沒有明顯變化，說明8%NaCl對突變菌株沒有產生脅迫作用。這些結果也印證了通過弱化PKA活性，來提高釀酒酵母的耐受性這一觀點。

2.5 突變株AY12a-2與出發菌株AY12a的液體發酵

為對比檢驗突變菌株與出發菌株的發酵性能，本試驗采用1.2.5的發酵方法模擬白酒液態發酵，并按照方法1.2.4對發酵結果進行分析，結果見表2。

表2 親本菌株和改造菌株的發酵性能比較Table 2 Comparison of fermentation performance of original strain and transformation strain

由表2可知，發酵過程結束后，同等發酵時間內，突變菌株在發酵結束后剩余葡萄糖量較出發菌株葡萄糖剩余量少，CO2失重量有所增加，與此同時乙醇的產生量也對應提高了17.8%。說明突變菌株對葡萄糖的利用率有所提高。這表明在動態發酵過程中突變菌株對脅迫環境的耐受性優于出發菌株的耐受性，也從側面表明了突變菌株的耐受性能得到一定提升，并與耐受性試驗結果相符合。

3 結論

本試驗將AY12a作為出發菌株，利用長引物橋出發，敲除與PKA活性相關基因TPK3，從而獲得突變菌株AY12a-2，并對突變菌株及出發菌株進行生長性能，耐受性，以及發酵性能的測定，期望通過敲除TPK3基因，從而提高釀酒酵母的耐受性。結果表明，30℃的培養條件下，兩株菌株生長性能基本一致。突變菌株的耐熱擊性能、耐乙酸性能及耐鹽性明顯優于出發菌株。同時發酵數據表明，同等發酵時間內，突變菌株的葡萄糖消耗量增加及CO2的失重量提升34%，乙醇產量增長了17.8%。總體來看，本試驗當中突變菌株的耐受性以及發酵性能都相對有所提升，為工業酵母菌株耐受性的提高提供思路。