食品中水溶性維生素測定方法的研究現狀

相壇壇，王明月，呂岱竹，郭建峰，梁水連，戎瑜，周佳

（1.中國熱帶農業科學院分析測試中心，海南 海口 571101；2.中北大學化學工程與技術學院，山西 太原 038507）

維生素是維持人和動物身體健康所必需的一種有機化合物，人體自身不能合成，必須從外界環境攝取。水溶性維生素作為維生素重要的一部分，對維持人體的正常生命活動極為重要。如維生素C主要參與人體內的羥化反應及氧化還原反應；維生素B1以輔酶的形式參與人體內能量與營養素的代謝；維生素B2主要參與體內能量代謝；維生素B6在人體內主要參與氨基酸的合成與分解代謝，催化血紅蛋白合成，促進肌肉與肝中的糖原轉化等；葉酸對體內紅細胞的合成有著重要的作用。水溶性維生素主要存在于粗糧、動物肝臟、蔬菜等食物中[1]，包括維生素C（VC）、維生素B1（VB1）、維生素B2（VB2）、維生素B3（VB3）、維生素B5（VB5）、維生素B6（VB6）、維生素B7（VB7），維生素B9（VB9）和維生素B12（VB12），當人體內的水溶性維生素不足或過量都會導致許多疾病發生[2]。

水溶性維生素很不穩定，在酸、堿、光、熱等條件下會發生降解，因此對其分析測定有些困難。傳統的分析方法包括微生物法、分光光度法，隨著現代分析測試技術的快速發展，水溶性維生素的檢測方法也變得更加豐富，超臨界色譜法、高效液相色譜法、液相-質譜聯用法等多種方法也被應用于水溶性維生素的檢測中，本文就近十年來現代分析測試技術在水溶性維生素測定方法中的應用進行了簡單綜述[3-6]。

1 水溶性維生素的檢測方法

1.1 微生物法

微生物法測定水溶性維生素含量是一種最常見的水溶性維生素檢測方法，是利用微生物的特異性，給予一定的營養條件或改變微生物的生存環境，通過其生長繁殖和代謝表達來完成對單一維生素成分的測定。

早在20世紀五十年代，英國維生素研究專家就利用微生物對來自不同動物的奶樣中的維生素B12含量進行了測定。我國學者于上世紀90年代開始使用微生物對食品中的維生素含量進行測定，經過近30年不斷的革新發展，微生物法測定維生素已非常成熟，在2017年頒布的國家標準中，利用微生物法分別對食用農產品中的煙酸和煙酰胺、泛酸、吡哆素、生物素及葉酸進行了測定。

利用微生物對維生素進行測定，微生物本身對生存環境極為敏感，且其特異性表達決定了微生物法檢出限低、靈敏度高、結果可靠的優點，但同時也因為微生物易染菌、特異性強造成了其具有培養周期長、重現性差、測定結果單一等缺點。劉冬虹等[7]優化建立微生物法快速測定嬰幼兒配方乳粉中的維生素B12、葉酸、生物素、肌醇4種水溶性維生素的方法。該方法利用甘油保護菌種，節省菌種制備時間，簡化試驗操作，同時菌種活力更穩定，保證了試驗的有效性；采用1.2mL PP小管和移液器進行操作，減少了大量移液管、玻璃器具的使用，節省了大量時間。該方法解決了傳統微生物法試驗周期長、操作復雜的問題。劉志楠等[8]用乳酸桿菌完成了牛奶中泛酸含量的測定，其在對泛酸含量測定時，應用了泛酸試劑盒，極大縮短了檢測時間。各種維生素檢測試劑盒因其簡單快速的優點必然將成為檢測維生素含量的一種不可或缺的工具。

微生物法是檢測維生素含量最簡單、最普遍的一種方法，在未來的發展中應該著力于其較差的重現性及檢測單一性等方面，從而使該方法更加完善。

1.2 光度法

光度法也是檢測水溶性維生素的一種常用方法，主要分為分光光度法和熒光光度法。

分光光度法利用水溶性維生素對紫外光有極強的吸收的特點，測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度。光度法對水溶性維生素的定性和定量分析，相對于微生物法，有靈敏度高、操作簡便快速、成本低的優點。葉群利等[9]利用分光光度法完成了黃果柑中維生素C的測定，以抗壞血酸標準品為對照品，于420 nm波長處測定吸光度值，結果準確、回收率好。但分光光度法在實際操作中過程繁瑣，花費時間較長，且在測定時有過多的干擾項，穩定性差。

分子熒光法有靈敏度高，檢出能力強的優點，一般用于自身含有熒光基團或者衍生后能有熒光特性的物質，國標中維生素B1、維生素B2、泛酸、煙酰胺等都采用了熒光光度法。光度法的缺點在于前處理復雜，維生素往往要經過提取、皂化衍生化等步驟，且不同的維生素往往前處理方法不同，不具備高效快速的特點。

1.3 毛細管電泳法

高效毛細管電泳法起步于20世紀80年代末，是近年來發展最快的分析方法之一。它是以高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離分析的液相分離方法。

毛細管電泳法具有高效、快速、分析對象廣的優點，近年來有許多學者利用其對水溶性維生素進行了測定。柯月嬌等[10]建立了高效毛細管電泳同時測定5種水溶性維生素的方法，該方法在6 min內可以對5種水溶性維生素進行分離，以出峰時間進行定性、峰面積進行定量，對食品中的維生素進行定性定量分析。尤慧艷[11]采用毛細管電泳法對常見的8種水溶性維生素的快速分離分析電泳條件作了比較深入的探討，通過雙模對接高壓電源，實現了40 kV以上的超高壓，并通過優化其它條件，保證了系統穩定性，在2.2 min內成功地分離了維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素C、維生素B5、生物素，煙酸和葉酸8種水溶性維生素，為研究水溶性維生素的檢測方法提供了新思路。但毛細管由于其直徑較小，所以檢測時靈敏度相對較低；電滲也會受到樣品成分的影響，重現性不好。

1.4 液相色譜法

色譜分析是按物質在固定相與流動相間分配系數的差別而進行分析、分離的方法，相較于傳統的分析測試方法，色譜法有著更短的檢測時間，更高的檢測效率，更準確的檢測結果等優點[12]。高效液相色譜用高壓輸液系統，以液體為流動相，將具有極性不同的單一溶劑或者比例不同的混合溶液等流動相輸送入裝有固定相的色譜分析柱，在柱內進行分離分配，進入合適的檢測器完成對試樣的分析測試，其較普通液相色譜具有高壓、高速、高效、高靈敏度的特點，且色譜柱可反復使用，樣品在短時間內可以回收[13]。

水溶性維生素是維持人體生命活動必不可少的重要化合物之一，與人體的健康機能息息相關，高效液相色譜法是目前測定水溶性維生素最普遍的方法，國內外已有許多方法對其進行測定。任丹丹等[14]建立了同時測定食品中9種維生素的高效液相色譜分析方法，該方法能同時對維生素C、硫胺素、核黃素、煙酰胺、吡哆醇、泛酸、生物素、葉酸和氰鈷胺9種水溶性維生素進行檢測，線性相關系數為0.999 7～0.999 9，相對標準偏差為0.28%～1.35%，檢出限范圍為3 ng/mL～45 ng/mL，加標回收率為90.6%～105.4%。郭建博等[15]建立一種快速測定10種水溶性維生素的超高液相色譜的檢測方法，該方法能夠在10 min內完成10種水溶性維生素的測定，10種水溶性維生素在該方法下線性關系良好（r＞0.999），精密度（relative standard deviation，RSD）值小于2%。Saad等[16]建立了快速測定多種食品中水溶性維生素的方法，該方法成功地應用于7種水溶性維生素的混合物的分析，平均回收率為98.14%～100.96%。用液相色譜對水溶性維生素進行檢測可實現高效快速的目的，但在實際測定中，還需從維生素本身出發考慮一些問題。

水溶性維生素種類多，不同種類的水溶性維生素其理化性質也有很大的差異。不同種類的水溶性維生素在溶液及光、熱、空氣中的穩定性見表1。

表1 不同種類的水溶性維生素在溶液及光、熱、空氣中的穩定性Table 1 Stability of different kinds of water-soluble vitamins in solution，light，heat and air

林江麗等[17]建立了高效液相色譜同時測定SO2處理前后無核葡萄干中4種水溶性維生素的分析方法，結果表明，用SO2處理對葡萄干中維生素B1的含量影響最大，其他3種B族維生素的含量變化不大。Kim等[18]建立離子對試劑測定和定量動物飼料中6種水溶性維生素的方法，表明利用離子對試劑對維生素的分離及測定會有較大的影響。這些文獻都表明在對維生素進行提取時應注意到提取溶劑可能對維生素的含量造成一定的影響，要選擇合適的提取溶劑對維生素進行提取，選擇合適的流動相對維生素進行分離。

水溶性維生素因其含有如羥基、醛基、共軛雙鍵等生色基團，對紫外光有良好的吸收度。在檢測中，通常用紫外檢測器對其進行分析測定。薛淼等[19]通過高效液相色譜法在波長為266 nm下分別測定了4種茶葉中維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素C和煙酸的含量，為茶葉加工品質控制及研究維生素在茶葉加工過程中的變化提供一種檢測方法。王雪梅等[20]采用高效液相色譜法在254 nm的波長下同時測定了新鮮草莓中維生素C、維生素B1、維生素B2和煙酸的含量，其回收率為96.1%～107.7%，變異系數為0.912%～1.56%。Rejaul[21]利用紫外檢測器在13 min內分離測定了8種水溶性維生素，其回歸系數r＜0.993，精密度0.3%～2.77%，準確度83%～124%，這些文獻都表明應用紫外檢測器對維生素進行分離測定具有很大的優勢。水溶性維生素的紫外最大吸收波長見表2。

表2 水溶性維生素的紫外最大吸收波長Table 2 Maximum UV absorption wavelength of water-soluble vitamins

當然，對水溶性維生素的檢測不僅僅局限于紫外檢測器，許多學者也用了其他檢測器對水溶性維生素進行了測定，Anna等[22]通過高效液相色譜-光電二極管陣列-熒光法在30 min內分離測定了功能飲料中13種水溶性維生素的含量，以及維生素補充劑的含量。Swen等[23]采用紫外-二極管列陣-熒光法依次對6種水溶性維生素的含量進行了測定。在維生素的實際測定中，不能局限于一種檢測器，可適當應用不同的檢測器對其進行測定。

液相色譜法在維生素含量的測定中作用顯著，在以后的實際應用中，應結合液相色譜的優勢及維生素的理化性質開發出更多、更簡、更優的檢測方法。這對檢測維生素的含量、研究不同種類維生素的作用、維生素的提取利用都將有很重要的意義。

1.5 液相色譜-質譜法

液相色譜-質譜聯用作為近些年出現的一種新的分析檢測方法，為食品和醫療等領域的分析檢測技術提供了更廣闊的發展前景。液相色譜-質譜分析將色譜的高效迅速和質譜的高靈敏度、強定性力有效結合起來，可以同時對多種不同樣品進行定性及定量分析[24-25]。其先利用高效液相色譜對不同樣品進行有效的分離，然后利用質譜檢測器所具有的高專一性、高選擇性、高靈敏度對不同樣品進行分析測定[26]。Hubo等[27]建立了高效液相色譜-串聯質譜法同時測定煙草制品中咖啡因、牛磺酸和5種水溶性維生素（維生素B1、維生素 B2、維生素 B3、維生素 B9、維生素 B12）的方法，線性系數大于0.997，回收率為95.1%～102.8%，該方法可用于批量測定和檢測煙草制品中水溶性維生素的含量。施煜等[28]建立液相色譜-質譜法快速測定運動飲料中維生素B1、維生素B2、泛酸、維生素B6、生物素、葉酸、維生素B12、煙酸、煙酰胺9種水溶性維生素的方法。相關系數大于0.999，回收率為90%～102.3%，該方法適用于運動飲料中維生素的測定。寧霄等[29]建立超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法同時測定保健食品中10種水溶性維生素，10種水溶性維生素在6 min內完成分離，線性相關系數大于0.997，回收率為85.9%～109.5%，該方法適用于保健食品中維生素的測定。水溶性維生素的質譜檢測參數見表3。

表3 水溶性維生素的質譜檢測參數Table 3 Parameters of water-soluble vitamins by mass spectrometry

液質聯用在實際使用中會產生基質效應從而影響結果的準確度。基質效應是指色譜分離時供洗脫的物質改變了待測成分的離子化效率，從而引起信號的抑制或提高，很大程度上破壞了結果的穩定性及重現性。通過改善樣品前處理方法、改善色譜條件、改善離子化方式、減小進樣量等方法可以減小基質效應。詹越城等[30]建立了食品中牛磺酸、維生素B1、維生素B2、煙酸、煙酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、葉酸、維生素B12、生物素12種水溶性維生素含量的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，該方法較好地減少了基質效應的影響，有極好的準確性和高靈敏度。邊麗娜[31]通過建立一種高效液相色譜-串聯質譜檢測法，對嬰幼兒配方食品中的11種水溶性維生素進行同步檢測。該方法通過優化色譜條件減少了基質效應對結果的影響，對于實驗室提高食品檢測效率有著重要意義。

利用液相色譜-質譜測定水溶性維生素時應通過不斷優化色譜條件、優化前處理過程使水溶性維生素檢測流程更簡便、檢測準確性更好、檢測靈敏度更高。

1.6 超臨界色譜法

超臨界流體色譜法也是近年來發展較為迅速的一種檢測方法，以超臨界流體作為流動相的一種色譜方法。超臨界流體指的是流體在高于臨界壓力和臨界溫度時的一種物質狀態，它具有低黏度、高密度及較高的擴散系數等特性。超臨界流體色譜既可以分析氣相色譜法難以處理的高沸點、不揮發樣品，又有比液相色譜法更高的柱效和更短的分析時間。理論上講，其應用于維生素的定性、定量分析也應更加方便。張春蘭等[32]采用超臨界流體色譜快速測定了復合維生素中3種維生素含量；線性關系良好，平均回收率介于97.3%～104.8%。竹宏等[33]利用超臨界流體色譜法建立同時測定維生素B2、維生素B3、維生素B5、維生素B64種水溶性維生素的方法，試驗結果表現出高效、快速，重現性和穩定性高的優點。這些試驗證明了超臨界流體色譜測定水溶性維生素的可行性，為進一步利用超臨界流體色譜測定水溶性維生素提供了思路。

超臨界色譜應用于維生素檢測時，相對于其他方法具有更高的檢測效率，更短的檢測時間，但由于有些水溶性維生素的極性限制難以使用超臨界色譜對其進行測定。

2 水溶性維生素檢測方法比較

伴隨現代分析測試技術的發展，水溶性維生素檢測方法也越來越多樣化。現階段對水溶性維生素的檢測主要使用液相色譜法，微生物法和光度法也有使用。國家標準中規定了一些水溶性維生素的檢測標準，例如在對食用農產品煙酸和煙酰胺的測定標準中，規定了微生物法和高效液相色譜法2種方法，其中微生物法的檢出限為50 ng/mL～500 ng/mL，液相色譜法的檢出限為煙酸 30 μg/100 g，煙酰胺為 40 μg/10 g。毛細管電泳法和超臨界色譜法對水溶性維生素進行檢測在近些年也多有報道。不同水溶性維生素檢測方法優缺點對比見表4。

表4 不同水溶性維生素檢測方法優缺點對比Table 4 Comparison of advantages and disadvantages of different water-soluble vitamin detection methods

表4對近年來水溶性維生素的檢測方法的優缺點進行了對比，以方便針對不同檢測需求選擇合適的檢測方法。

3 展望

當今，人們已經越來越重視健康問題，水溶性維生素作為維持人體生命健康的一種極為重要的有機化合物，已被越來越多的人關注和重視。雖然已經可以利用液相色譜-質譜等方法對維生素進行定性定量分析，但在國標方法中對維生素的測定方法還未更新，且沒有一個完整有效的包含多種維生素的檢測標準，對檢測標準的更新和拓展應作為水溶性維生素檢測的一個研究方向。同時，檢測的應用面也應予以擴大，將維生素檢測方法應用于飼料、水果、藥品、飲料、發酵乳制品，以及人體新陳代謝物的研究，這對食品健康與品質的提升，人體健康發育都有著極其深遠的意義[34-38]。

近年來，由于各種高新材料及高新技術的發展，全球科學儀器產生天翻地覆的變化，給分析測試的發展帶來了廣闊的前景，這也意味著水溶性維生素的檢測方法和手段也將越來越先進。在未來，采用基因層次技術、納米級材料對維生素進行提取，分子層次的剖析以及全球網絡的成果共享必然使水溶性維生素的檢測向更微量、過程更高效、結果更精密的方向發展，也會使檢測應用面更廣。