白酒釀造微生物分析方法研究進展

蔡鳳嬌，蔣燕明，饒建軍，夏燕，李大海，張瑞景，徐健*

（1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；2.湖北琪譜檢測技術有限公司，湖北 武漢 430068；3.丹陽頤和食品有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212300）

白酒是一種具有幾千年文化歷史的中國傳統(tǒng)蒸餾酒，也是世界上消費量最大的蒸餾酒之一[1]。白酒生產(chǎn)過程中，微生物的種類、數(shù)量、分布及其消長變化等是影響酒的風味品質(zhì)以及其典型香型的重要因素[2]。了解白酒風味產(chǎn)生的機理及白酒釀造過程中微生物的功能，并將其分離純化從而進一步研究利用是提升白酒質(zhì)量口感的一個重要途徑。

傳統(tǒng)的平板分離方法讓成千上萬的釀造微生物得以分離從而可以進行后續(xù)研究，但截至目前，能用平板進行分離培養(yǎng)的微生物僅占0.1%～1.0%[3]。隨著基于以聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），如變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、定量實時 PCR（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、高通量測序等分子生物學技術的應用，復雜體系的微生物群落結(jié)構(gòu)及功能研究蓬勃發(fā)展[4-7]。現(xiàn)代生物測序可以分析更多的微生物，挖掘它們的功能基因，同時，這些代謝途徑獨特，具有特殊功能的微生物需要傳統(tǒng)平板培養(yǎng)分離來驗證其生理代謝特性，才能進一步加以應用[8]。因此，關于白酒釀造微生物的研究，現(xiàn)代生物測序法與傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法需要互為補充、相輔相成。而且，隨著氣相色譜、高效液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用等分析方法以及統(tǒng)計學方法的應用，微生物的代謝功能及代謝產(chǎn)物研究更加方便。

對平板分離、以PCR為基礎的微生物指紋圖譜、高通量測序等技術在白酒釀造微生物中的應用，以及微生物與風味化合物的關聯(lián)性分析進行介紹，并比較不同方法之間的差異性，可以為白酒釀造微生物的研究提供參考。

1 平板分離鑒定方法

傳統(tǒng)的平板分離鑒定方法是在白酒生產(chǎn)過程中，通過不同的篩選培養(yǎng)基將其多次分離純化培養(yǎng)后進行菌種鑒定。平板分離鑒定方法雖然耗時比較長且分離的微生物種類有限，但在功能性菌株的篩選及研究中是必要且有效的。越來越多的研究者從白酒生產(chǎn)的原料、酒曲及環(huán)境中篩選分離出功能性菌株。因此，傳統(tǒng)平板分離鑒定方法依舊是白酒釀造微生物研究的一個重要手段。

白酒釀造過程中，糖化酶、淀粉酶、蛋白酶對原料的分解利用為白酒微生物提供可利用的糖和氨基酸，供微生物繁殖代謝產(chǎn)生風味物質(zhì)。梁香等[9]用平板劃線分離法從黃酒酒曲中分離出12株糖化菌株，并用孟加拉紅培養(yǎng)基篩選分離出一株具有優(yōu)良糖化功能的曲霉菌株。鐘小娟等[10]用淀粉酶培養(yǎng)基從酒鬼酒制曲車間內(nèi)篩選分離出4株產(chǎn)高活力淀粉酶的芽孢桿菌。酯類化合物在白酒風味物質(zhì)中占比較大，是影響白酒風味口感的重要因素。Zhao等[11]從濃香型白酒發(fā)酵酒醅中篩選出一株能產(chǎn)生214.7 mg/100 mL己酸乙酯的蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereu），該菌株的應用可以提高白酒中己酸乙酯含量從而改善濃香型白酒風味。Fan等[12]從古井貢大曲中篩選分離出一株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604，在最優(yōu)的發(fā)酵條件下，該菌株的乙酸乙酯產(chǎn)量達到16.92 g/L。功能性白酒釀造微生物也經(jīng)常被篩選應用于其它發(fā)酵食品。騰軍偉等[13-14]用平板劃線分離法從江米酒酒曲中分離出11株細菌和2株真菌，并用酪蛋白平板篩選分離出1株高產(chǎn)凝乳酶的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），將該菌株應用于馬蘇里拉干酪的生產(chǎn)，提高了干酪中可溶性蛋白及游離氨基酸的含量。

傳統(tǒng)平板分離法雖在白酒釀造微生物的分離鑒定中有著重要作用，但其只能分離易于培養(yǎng)的微生物，且耗時長，因而無法全面、高效地了解白酒釀造中微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)。應用分子生物學技術可以從多層面分析釀造微生物的群落結(jié)構(gòu)及功能，有效地解決了這一問題。

2 以PCR為基礎的微生物DNA指紋圖譜鑒定技術

由于傳統(tǒng)平板分離鑒定方法的局限性，以PCR為基礎的微生物DNA指紋圖譜方法迅速發(fā)展，如表1所示，微生物指紋圖譜的應用相比于傳統(tǒng)平板分離方法能更加快速準確地鑒定微生物甚至是不可培養(yǎng)的微生物個體，同時對白酒釀造微生物的群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律、動態(tài)變化進行分析。

表1 白酒釀造微生物群落研究方法及比較Table 1 Research methods and comparison of microbial communities in Baijiu brewing

續(xù)表1 白酒釀造微生物群落研究方法及比較Continue table 1 Research methods and comparison of microbial communities in Baijiu brewing

RT-qPCR是PCR技術的升級，RT-qPCR技術通過熒光信號分析擴增產(chǎn)物，通過標準曲線定量分析樣品模板，可推斷出目的基因的初始量[29]。白酒釀造過程中各微生物的數(shù)量是不斷變化的，而傳統(tǒng)平板分離法對于不可培養(yǎng)的微生物無法監(jiān)測其變化，利用RT-qPCR技術可以及時有效地了解到更多白酒釀造微生物的種類及數(shù)量變化。

PCR-DGGE不需要經(jīng)過耗時的傳統(tǒng)培養(yǎng)分離，通過樣品中微生物的DNA或RNA信息就可以直接對微生物進行鑒定分析，是分析微生物群落結(jié)構(gòu)的有效方法[30]。Zhang等[31]首先將PCR-DGGE技術應用到白酒研究中，結(jié)果表明濃香型白酒的真菌群落具有較高的多樣性，真菌多樣性的變化表明真菌的種類隨著發(fā)酵時間延長而不斷降低，并且還構(gòu)建了包含120個18S rRNA克隆序列的基因克隆文庫。王海燕[6]運用PCRDGGE技術研究了清香型汾酒大曲和酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)演變規(guī)律，在大曲中檢測到16個種屬的微生物，發(fā)現(xiàn)了更多傳統(tǒng)平板分離方法未能檢測到的菌種。向凡舒等[16]應用PCR-DGGE技術對古襄陽白酒窖泥微生物進行多樣性分析，明確了新窖與老窖中的微生物多樣性具有明顯差別，且新窖中主要以耐酸乳桿菌為主。PCR-DGGE技術僅能檢測含量在1%以上的主要微生物，且其結(jié)果分析依賴于基因數(shù)據(jù)庫，因基因數(shù)據(jù)庫的序列信息不夠全面，因此該方法也有一定局限性。

PCR-SSCP可以檢測任何（包括已知和未知的）DNA位點上的多態(tài)性和突變，靈敏度高，適合于DNA變異的檢測，也可以用來分析白酒釀造微生物的多樣性。羅惠波[4]用PCR-SSCP對濃香型大曲微生物群落進行分析，結(jié)果表明，發(fā)酵各時期曲樣的群落結(jié)構(gòu)相似，同時也具有多態(tài)性。

末端限制性片段長度多態(tài)性（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）也是以 PCR 為基礎的DNA指紋圖譜技術，它可以快速準確地估算微生物的豐富度和群落組成[32]。T-RFLP的原理是在PCR中使用了一組熒光標記的引物，從細菌群落DNA擴增部分16S rDNA序列。然后，將所得的混合擴增子進行限制酶切，以產(chǎn)生熒光標記的末端限制片段的混合物，其具有與特定微生物相對應的特定大小。每個末端限制片段的確切大小再經(jīng)過毛細管電泳來確定。

擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術是從基因組DNA限制性酶切片段進行選擇性PCR擴增。它涉及兩個擴增步驟：低水平或預選擇性擴增，然后是更具選擇性的擴增，這會生成一組片段，可用作特定樣品的特異性標記。Lazzi等[20]應用AFLP技術對78株嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）進行了遺傳性表征，更好地了解了嗜熱鏈球菌的微生物多樣性。

3 高通量測序技術

高通量測序技術相對于微生物DNA指紋圖譜方法來說檢測的通量更大，檢測限更低，也因它具有靈敏度高、準確性強、可處理數(shù)據(jù)大等特點而得到廣泛應用[33]。它通過對微生物群體進行高通量測序，可以短時間內(nèi)測定幾百萬條到10億條DNA序列，并且，檢測限相比于PCR為基礎的指紋圖譜更低。目前常用的高通量測序方法包括擴增子測序、宏基因組測序、宏轉(zhuǎn)錄組測序等。

擴增子測序技術在白酒微生物群落結(jié)構(gòu)研究中最為常見，它是基于微生物基因組的特征性序列進行測序和分類，研究目的傾向于物種的分類識別和相對豐度統(tǒng)計。Wang等[34]對不同輪次醬香型白酒發(fā)酵過程總的微生物群落進行擴增子測序，結(jié)果共鑒定出27個細菌門（包括658個屬），7個真菌門（包括156個屬），并且在7個輪次發(fā)酵過程中核心微生物群為Bacillu、Lentibacillus、Kroppenstendtia、Oceanobacillus、Lactobacills、Thermomyces、Byssochlamys、Thermoascus等。李小龍[35]運用擴增子測序技術研究芝麻香型白酒發(fā)酵微生物群落，結(jié)果表明其優(yōu)勢屬包括Lactobacillus、Bacillus、Pichia、Saccharomyces、Aspergillus、Wickerhamomyces和Geotrichum，然后選擇豐度和分布具有差異的微生物強化發(fā)酵酒醅并應用到窖池，結(jié)果乙酸乙酯等10種重要揮發(fā)性化合物含量提高，使得酒體的口感質(zhì)量提高，但并未破壞酒體的整體風味輪廓。

宏基因組測序技術不需要特異性擴增，直接對樣本中所有存在的DNA進行測序，進一步開展物種識別鑒定和基因功能研究。它可以直接獲取DNA水平的基因功能注釋，因此，相對于擴增子技術而言，宏基因組的隨機測序更有利于研究實際檢測樣本中微生物的功能。Tao等[36]對濃香型白酒窖泥進行宏基因組測序分析，得到了己酸合成途徑中的關鍵酶，并構(gòu)建了Clostridium、ClostridialclusterIV、Methanoculleus和 Methanosarins的己酸合成途徑。于學健等[37]對芝麻香型高溫大曲的高溫放線菌進行宏基因組測序，揭示了高溫放線菌及其功能基因與大曲理化性質(zhì)的關系，結(jié)果表明高溫放線菌的豐度上升，碳水化合物降解相關基因逐漸富集，促進大曲糖化力與酯化力提升。

宏轉(zhuǎn)錄組測序有別于宏基因組，以DNA為研究對象，它是對樣本中存在的RNA進行測序。宏轉(zhuǎn)錄組測序獲得的是活性物種、表達中的活性基因和活性功能等信息。活性微生物會根據(jù)生理及環(huán)境的變化調(diào)節(jié)自身的基因表達和功能發(fā)揮，因此，宏轉(zhuǎn)錄組測序?qū)τ趶碗s微生物群落的動態(tài)活性研究具有重要意義。宋哲瑋等[27]運用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔擴增子和宏轉(zhuǎn)錄組測序?qū)︶u香型白酒發(fā)酵過程進行了研究，結(jié)果表明醬香型白酒發(fā)酵過程涉及10個屬的酵母微生物，且Pichia kudriavzevii和Schizosaccharomyces pombe是醬香型白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢酵母。田源等[28]運用宏轉(zhuǎn)錄組測序分析研究濃香型窖池內(nèi)微生物的正丙醇合成途徑，結(jié)果表明濃香型窖池內(nèi)有2-甲基蘋果酸代謝途徑、蘇氨酸代謝途徑和丙酸代謝途徑，且真菌主要通過前兩種途徑合成正丙醇，而細菌主要是通過后一種途徑。

4 其它分析方法

Biolog微平板法是專門為復雜樣品的細菌群落分析而創(chuàng)建的，相比于傳統(tǒng)的平板計數(shù)方法，它更能反映微生物群落的生態(tài)活性情況。它們包含多種生態(tài)碳源，不同的微生物可以使用不同的碳源來支持其不同的代謝功能，因此，Biolog微平板可潛在地用于分析微生物群落狀態(tài)。李浩等[38]采用Biolog微平板法對濃香型大曲微生物多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)該大曲微生物根據(jù)Biolog反映的特征性圖紋可分為5類。

磷脂脂肪酸法（phospholipid fatty acids，PLFA）是一種根據(jù)樣品中磷脂的信息來反映微生物的生物量，從而反映微生物的演替情況的方法。因此，它能快速反映出微生物是否受到環(huán)境微生物的影響變化，能提供更多表型和生物活性信息。張紅霞[23]運用PLFA對3種清香型白酒大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)進行了解析，發(fā)現(xiàn)微生物種類及含量在3種大曲中呈現(xiàn)出較大差異。

5 白酒釀造微生物與風味化合物的關聯(lián)性分析

釀造微生物對于白酒生產(chǎn)的主要貢獻為通過繁殖代謝，將谷物等原料轉(zhuǎn)化為乙醇和各種風味物質(zhì)。在進行釀造微生物的代謝特性研究時，研究者們通常對分離篩選的微生物進行單菌發(fā)酵、混菌發(fā)酵或者將其應用到制曲，并在發(fā)酵過程中作為強化劑進行添加來研究其對白酒風味的影響。不管是白酒釀造微生物群落研究，還是風味物質(zhì)研究，都會產(chǎn)生大量的樣本信息數(shù)據(jù)，包括其含量、種類等。因此，在紛繁復雜的數(shù)據(jù)中將釀造微生物與其發(fā)酵體系中的風味成分進行科學的分析和關聯(lián)，是研究微生物對白酒風味影響的一個重要環(huán)節(jié)。

運用統(tǒng)計學分析方法可以更好地對數(shù)據(jù)進行排序、分類、建立聯(lián)系，如表2所示。

表2 微生物與風味化合物關聯(lián)性研究中的統(tǒng)計分析方法Table 2 Statistical analysis methods in the research of the correlation between microorganisms and flavor compounds

續(xù)表2 微生物與風味化合物關聯(lián)性研究中的統(tǒng)計分析方法Continue table 2 Statistical analysis methods in the research of the correlation between microorganisms and flavor compounds

排序分析可以從大量的數(shù)據(jù)中提取出主要信息，在分析白酒釀造微生物和風味化合物時應用廣泛，常用的排序分析方法有主成分分析（principal component analysis，PCA）、主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）等。劉凡等[25]運用主成分分析和偏最小二乘回歸對洋河酒廠濃香型白酒發(fā)酵過程中微生物與主要有機酸進行分析，得到了Lactobacillus、Staphylococcus、Saccharomyces、Naumovozyma、Issatchenkia、Psychrobacillus和Rhizopus這7種與主要有機酸合成的關鍵微生物。Liu等[40]將糯米酒釀造過程中不同階段的揮發(fā)性化合物和微生物群落分別進行PCA分析和PCoA分析，可以清楚地觀察到發(fā)酵過程中主要的40種化合物和24個樣本中細菌、真菌類群落的動態(tài)變化。聚類分析是一種常用的數(shù)據(jù)分類方法，熱圖、樹形圖都是常見的通過聚類分析而將數(shù)據(jù)進行分類并且可視化的表示方式。騰軍偉等[13]利用層級聚類分析將不同酵母固液態(tài)發(fā)酵的揮發(fā)性產(chǎn)物繪制成樹形圖進行可視化比較，直觀清楚地展示了不同酵母的代謝產(chǎn)物及產(chǎn)量的異同。

相關性與回歸分析在微生物和風味化合物研究中，能將眾多不同類型之間的變量或數(shù)據(jù)建立聯(lián)系或區(qū)分。偏最小二乘回歸分析法適用于多變量之間建立聯(lián)系，常用于研究復雜發(fā)酵體系中具體微生物與風味物質(zhì)之間的相關性。Kong等[44]研究酵母菌的代謝作用時，運用偏最小二乘回歸分析，得到了8種酵母菌與16種風味物質(zhì)之間的關聯(lián)性，如異常畢赤酵母與乳酸乙酯、十四酸乙酯等物質(zhì)的生成有關。微生物關聯(lián)網(wǎng)絡也是常用的在微生物與微生物、微生物與風味化合物之間進行相關系數(shù)計算，并構(gòu)建網(wǎng)絡圖來展示相互關系的處理方法。Liu等[40]根據(jù)Pearson相關系數(shù)，在古田紅曲糯米酒釀造過程中核心微生物和主要化合物之間建立關聯(lián)網(wǎng)絡，表征了40種主要揮發(fā)性化合物和20種核心真菌、細菌之間的高度相關關系，包括44對高度正相關和9對高度負相關關系。

由此可見，在微生物群落研究、風味化合物研究及探尋釀造微生物與風味成分形成之間的關系時，統(tǒng)計學分析是一項非常有效的、關鍵的處理方法。合理科學地運用統(tǒng)計學分析可以對數(shù)據(jù)進行更好地挖掘和多方面評估，從而讓試驗結(jié)論更加科學全面。

6 總結(jié)與展望

白酒釀造微生物的研究是一項復雜且具有重大意義的工作，對白酒釀造微生物的分離鑒定及群落結(jié)構(gòu)分析方法、白酒釀造微生物與風味化合物的關聯(lián)性分析方法進行綜述，可以為白酒釀造微生物的系統(tǒng)研究提供參考，以此來更好地為白酒質(zhì)量的提升打下基礎。白酒釀造微生物的研究不僅是要分離鑒定更多的微生物，了解微生物的區(qū)系結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化情況，還要分析其生理特點、代謝途徑、代謝產(chǎn)物等功能特性，如此才能分析白酒的風味產(chǎn)生機理，將白酒釀造微生物的研究成果應用到白酒的風味品質(zhì)提升上。隨著高通量測序及質(zhì)譜技術的發(fā)展，白酒釀造微生物的研究更深入、高效和全面。宏轉(zhuǎn)錄組學、宏基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學等方法可以綜合運用，在明確微生物的種類、群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化的基礎上，挖掘更多的功能基因，探尋微生物內(nèi)的代謝通路、合成風味化合物有關的關鍵酶，構(gòu)建白酒釀造微生物功能基因庫，了解微生物之間的相互作用關系，為白酒釀造微生物的代謝調(diào)控及定向選育提供理論基礎，進而將微生物理論研究轉(zhuǎn)化為應用研究，從而促進白酒釀造微生物的產(chǎn)業(yè)化應用及白酒釀造技術的升級。