Holliday交叉識別蛋白表達與胃癌發(fā)生發(fā)展及其預后的關(guān)系

王立 謝鵬 賀小武 季世偉 周建平

中國是胃癌高發(fā)區(qū)［1］，>60%的胃癌患者在初診時已處于進展期，預后較差［2］。為改善胃癌預后，現(xiàn)丞需尋找新的分子生物學標志物，Holliday交叉識別蛋白（HJURP）位于人染色體的2q37.1上，長約17.73kb，有9個外顯子、2529個核苷酸，編碼748個氨基酸［3］，是著絲粒蛋白A的分子伴侶（CENP-A），與CENP-A結(jié)合促進CENP-A在核小體上的招募，輔助核小體裝配，若其功能不全，可能會導致腫瘤發(fā)生［4］。已有研究報道，HJURP在乳腺癌、肝癌中呈現(xiàn)高表達，且與不良預后相關(guān)［5-6］，但HJURP在胃腺癌中的高表達與預后并不相關(guān)［7］。本研究擬通過檢測HJURP在胃癌及正常胃組織中的表達，分析其與臨床病理及預后的相關(guān)性，探討HJURP基因與胃癌之間可能存在的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年1月至2016年12月本院普外科收治的胃癌患者79例，胃癌根治術(shù)前均未接受放、化療等治療。其中，男58例，女21例；年齡36～83歲，中位年齡66歲；腫瘤直徑≥5 cm者26例，腫瘤直徑<5 cm者53例（若腫塊為潰瘍型，以潰瘍最外側(cè)緣為界確定腫瘤直徑）；病理組織學類型，中高分化癌51例、低分化或未分化癌28例；胃壁浸潤程度即胃壁侵犯深度，T1/T2 17例、T3/T4 62例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例；TNM分期參照2018年美國癌癥聯(lián)合委員會標準，Ⅰ/Ⅱ期30例、Ⅲ/Ⅳ期49例；術(shù)后病理證實脈管有癌栓者43例，無癌栓者36例；術(shù)前CEA≥5 ng/mL者63例，<5 ng/mL者16例；術(shù)后電話或門診隨訪，死亡44例，中位生存期39個月。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 收集79例胃癌患者的胃癌組織作為實驗樣本，另隨機選取同期于本院就診的胃良性疾病患者27例，收集其正常胃組織（非癌樣本旁的正常胃組織）作為對照樣本。采用免疫組化二步法檢測正常胃部組織、胃癌組織中HJURP蛋白的表達。病理蠟塊連續(xù)切片，厚度3～5 μm，3片；將切片放入60 ℃烤箱烘烤2 h；二甲苯浸泡2次，進行脫蠟，每次5 min；無水乙醇2次、95%乙醇1次、70%乙醇1次，進行水化，每次3 min；然后，純水漂洗3 min，95 ℃預熱，0.01 M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）抗原修復20 min，加入3%過氧化氫甲醇溶液靜置10 min進行阻斷，加入5%BSA封閉液室溫靜置20 min封閉，滴加HJURP一抗（1∶200）4 ℃過夜，滴加辣根酶標記的兔二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染后封片。實驗中使用磷酸鹽緩沖液（PBS）作為一抗的陰性對照，HJURP一抗和辣根酶標記兔二抗均購自AbCAM 公司。病理讀片、判斷分別由一位病理科主任醫(yī)師和一位病理科副主任醫(yī)師獨立完成。

1.3 觀察指標 HJURP在胃癌組織中的表達情況，病理判讀評分：染色范圍未著色為0分，<25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分；染色強度評分范圍為0～3分；以染色強度評分與染色范圍評分的乘積作為最終評分，并據(jù)此將實驗樣本分為陰性組（0～2分）和陽性組（3～9分）。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher精準；生存曲線采用Kaplan-Meier方法評估，并用log-rank檢驗比較差異；構(gòu)建單因素、多因素的Cox比例風險回歸模型預測生存期。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HJURP在胃癌及正常胃組織中的表達 HJURP主要表達于細胞質(zhì)中，見圖1。實驗樣本中陽性表達33例（41.8%），正常胃組織中陽性表達5例（18.5%），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.037）。

圖1 HJURP在胃癌及正常胃組織中的表達（免疫組化染色）

2.2 HJURP表達陽性組與陰性組的臨床病理資料比較 HJURP的表達水平與胃癌組織的淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期、脈管有無癌栓有相關(guān)（P<0.05），而與性別、年齡、術(shù)前CEA、腫瘤大小、分化程度、胃壁侵潤深度無關(guān)（P>0.05）。見表1。

表1 HJURP表達陽性組與陰性組的臨床病理資料比較

2.3 生存分析 79例胃癌患者的總體中位生存時間為56個月（95%CI：31.856-80.144），其中HJURP高表達患者的中位生存時間為36個月（95%CI：23.313-48.687），顯著低于HJURP低表達患者，log-rank檢驗顯示差異有統(tǒng)計學意義（P=0.005）。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖，見圖2。單因素Cox風險回歸分析，腫瘤的胃壁浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移及TMN分期、HJURP表達與生存期相關(guān)，可能是胃癌的臨床預后因子。進一步校正，納入單因素回歸分析中P<0.05的因素進行多因素Cox回歸，結(jié)果提示HJURP表達水平與腫瘤TNM分期等因素可以作為胃癌的預后因子預測患者的OS。見表2。

圖2 HJURP表達對胃癌患者生存期影響的Kaplan-Meier曲線

表2 影響胃癌患者預后的單因素、多因素Cox回歸分析

3 討論

流行病學證據(jù)顯示，環(huán)境、飲食等因素在胃癌的發(fā)生過程中起重要作用［8］。胃癌發(fā)病在世界范圍內(nèi)存在較大的地理、人群分布差異，中國、日本、韓國為代表的東亞地區(qū)發(fā)病率及死亡率明顯高于北美、歐洲及非洲地區(qū)［9］。與發(fā)病率同樣高的日本、韓國相比，中國胃癌患者的5年相對生存率較低，可能是由于我國大多數(shù)胃癌患者在發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，而胃癌的治療效果與首次診斷時間密切相關(guān)［10］。因此，積極發(fā)現(xiàn)新的分子生物學標記物，有助于提高胃癌的早期診斷率，協(xié)助臨床診療，延長我國胃癌患者的生存期。

HJURP于2007年由TATSUYA K等發(fā)現(xiàn)，是毛細血管擴增性共濟失調(diào)突變（ATM）通路的下游靶基因，DNA雙鏈斷裂（DBS）可以引起HJURP的表達增加，DNA損傷后HJURP參與DSB損傷修復過程中的同源重組，而DNA修復途徑中的重要成分表達異常往往會增加基因突變和腫瘤發(fā)生的機會。當HJURP表達被抑制，細胞內(nèi)會出現(xiàn)異常的染色體融合，引起基因的不穩(wěn)定性，因此認為HJURP是維持染色體穩(wěn)定的一個不可或缺的因素［5］。FOLTZ等［11］研究發(fā)現(xiàn)在著絲粒染色質(zhì)裝配過程中，HJURP是CENP-A的特異性分子伴侶。CENP-A是組蛋白H3的變異體，維持著絲粒定位并影響著絲粒的形成，對高保真染色體分離至關(guān)重要，而著絲粒的功能異常可導致染色體的異常分離，進而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生［12-13］。近年來，HJURP表達與惡性腫瘤的相關(guān)研究陸續(xù)出現(xiàn)，眾多研究提示HJURP表達異常可能與腫瘤的發(fā)生與預后相關(guān)。KATO等［5］發(fā)現(xiàn)HJURP通過參與DSB過程，參與維持染色體的穩(wěn)定及細胞永生，并觀察到HJURP表達異常與肺癌的不良預后相關(guān)。HU等［3］發(fā)現(xiàn)HJURP在肝細胞肝癌（HCC）組織中的表達明顯高于正常組織，且其高表達是HCC患者預后的獨立危險因素。遲鋮［7］研究發(fā)現(xiàn)，HJURP在胃腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，此種差異性表達與總體生存率無差別，但在未出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的胃腺癌患者中，HJURP高表達的胃腺癌患者總生存期明顯高于HJURP低表達的胃腺癌患者。

本研究對胃癌組織和正常胃組織的病理切片進行免疫組化染色，探討HJURP與胃癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中HJURP的表達明顯高于正常胃組織，進一步結(jié)合實驗樣本的臨床病理特征進行分析，結(jié)果提示HJURP的表達可能與胃癌組織的淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期、脈管有無癌栓相關(guān)，而與性別、年齡、術(shù)前CEA、腫瘤大小、分化程度、胃壁侵潤深度無關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中HJURP基因的高表達往往與患者的不良預后相關(guān)，提示HJURP表達可能是胃癌患者預后不良的獨立預測因子，這與HU等［3，5］研究HJURP在肝癌等腫瘤中的表達結(jié)果一致，但與遲鋮［7］研究HJURP在胃腺癌中的表達結(jié)果相悖，此種差異是否與入組患者的疾病分期、病理分型等不同因素相關(guān)，仍有待進一步深入研究。

綜上，HJURP未來可能會成為預測胃癌患者預后的一個重要指標，可通過檢測胃癌患者的HJURP表達，積極協(xié)助臨床診療以獲得更好的預后，甚至基于此分子基因靶點進行胃癌靶向治療相關(guān)分子通路及藥物的探索，為胃癌的治療提供新思路。