貉細小病毒RDPV-JL3株的分離鑒定及VP2基因序列分析

郭曉芹，于小亞，李滋睿，李卓宸，呂甜甜，曹海旭，宋海巖，趙傳芳※

（1.中國農業科學院特產研究所，吉林 長春130112；2.吉林省科技創新平臺管理中心，吉林 長春130012；3.中國農業科學院后勤服務中心，北京100081；4.吉林冠界生物技術有限公司，吉林 梅河口135000）

貉子，又名狗貍，是起源于東亞的一種本土食肉目犬科動物[1]。通過訓化后人工養殖的貉子背部毛皮質量能接近于藍狐的毛皮質量[2]，使得貉皮在國際市場中的價格不斷上漲，給毛皮養殖業帶來巨大的經濟效益。而貉細小病毒（RDPV）能引發貉細小病毒腸炎，是危害養貉業的重要傳染病之一[3]。幼貉的發病率在70%以上，死亡率高達90%，成齡貉的感染率和死亡率均在30%以下，多呈慢性和隱性感染，其帶毒的排泄物（糞便和尿液等）成為最危險的傳染源[4]。

RDPV屬于細小病毒科（Parvoviridae）細小病毒屬（Parvovirinae）成員，與犬細小病毒（CPV）、貓泛白細胞減少癥病毒（FPV）、水貂腸炎病毒（MEV）、浣熊細小病毒（RPV）以及藍狐細小病毒（BFPV）的基因組同源性高達98%以上[5]，肉食動物細小病毒被科學家認為是由同一始祖毒株在生態變化或自然選擇等因素的影響下，突破了種間屏障，獲得跨種屬傳播的能力后逐漸進化成的一種具有種屬特異性的病毒[6-9]。1978年CPV以CPV-2型首次在犬體中被發現，CPV-2作為一種新病原其最被研究學者認可的產生途徑是FPLV借助狐或貉等中間宿主變異進而感染犬出現的[10]。RDPV也被認為是CPV跨宿主感染貉產生[11]。RDPV自1984年（首次在我國黑龍江省發生）至今所分離出的毒株雖然大都屬于CPV-2亞型，但從2016開始，RDPV主要衣殼蛋白VP2上的多個氨基酸殘基發生了非同義性突變，如S27T、S297A和I418T，這種新型CPV-2可能是細小病毒進化的過渡階段[12,13]。

本實驗從吉林某養殖場疑似患貉細小病毒的貉腸道組織中成功分離出1株貉細小病毒，并對此分離毒株的VP2基因進行克隆測序和基因序列分析，了解該地區RDPV分子流行病學的變化趨勢，以期為更好的研究貉細小病毒病的診斷、疫苗防控以及揭示CPV-2進化機制提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料病料來自吉林省吉林市某貉養殖場，發病貉表現為嘔吐及腹瀉等，臨床癥狀疑似為RDPV感染，Anigen Rapid CPV Ag Test Kit檢測糞拭子顯示陽性，采集病死貉的腸組織及腸道內容物。

1.1.2 細胞及試劑貓腎傳代細胞F81株、RDPV陽性血清及RDPV VP2蛋白單抗由本實驗室保存；細胞培養用的胎牛血清、消化液胰酶及MEM購自Gibco公司；DNA Marker（DL5 000、DL2 000、DL1 000）基因組提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、Peasy-T1 Cloning Kit、大腸桿菌DH-5感受態細胞等購自北京全式金生物技術有限公司；LA Taq DNA聚合酶、購自Takara公司；Goat Anti-Mouse IgG（H+L）/FITC購自北京博奧森生物有限公司；引物由庫美生物科技有限公司合成。

1.1.3 儀器設備細胞培養箱、低溫離心機（Thermo公司產品）；凝膠成像儀（GE公司產品）；組織研磨儀（Thmorgen公司產品）；熒光倒置顯微鏡（Leica公司產品）。

1.2 方法

1.2.1 病料處理將采集的貉腸道組織及其內容物研磨充分后用PBS按1:5的比例稀釋，于﹣79℃反復凍融3次，5000r/min，4℃離心45min，取上清用0.22m濾膜過濾除菌后加入雙抗（Penicillin-Streptomycin,100），使其終濃度為100U/mL，4℃過夜后放入﹣79℃保存。

1.2.2 病毒分離培養將生長良好的F81細胞消化成細胞懸液，按2%同步接種病料上清，用含10%血清的MEM于37℃、5% CO2培養箱中培養，同時設立正常細胞對照，每天觀察細胞病變的情況。當細胞病變達80%左右收毒，反復凍融3次后置于﹣79℃保存備用。

1.2.3 DNA提取及PCR鑒定合成檢測引物后[14]于第三代細胞培養物中提取DNA進行PCR鑒定。反應總體積20L，模板1L，2 LA Taq酶10L，上、下游引物各1L，加dd H2O至總體積20L。PCR擴增程序94℃預變性4 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1min，32個循環；最后72℃延伸6min。擴增后的產物用0.9%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.4 血凝試驗（HA）使用96孔微量血凝板對RDPV陽性第3代細胞培養物上清進行HA測定，每孔先加入25L PBS緩沖液（pH 7.2），每排第1孔中加入25L的抗原，吹打混勻后吸25L至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，棄掉25L。第12孔作為紅細胞對照組，實驗設置2個重復和陽性對照組。每孔補加25L PBS，最后每孔加入50L 1%豬紅細胞懸液，震蕩均勻后于4℃靜置45 min后進行判定。將100%的紅細胞凝集判為陽性標準，對應的稀釋倍數即為該病毒的血凝效價。

1.2.5 病毒TCID50測定 調整F81細胞濃度約為2 105個/mL，每孔100L均勻鋪于96孔培養板中，同時將收取的有典型病變的第3代細胞培養液依次按10倍做倍比稀釋，分別接種于F81細胞96孔培養板中，每個滴度做8個重復，100L/孔，并設正常細胞對照組，觀察并記錄4 d內的病變孔數，按Reed-Muench法計算病毒TCID50。

1.2.6 間接免疫熒光（IFA）首先將F81細胞均勻鋪在96孔板并按體積的5%同步接種分離株病毒，于37℃，5% CO2培養箱中培養；根據細胞狀態，棄上清液，用PBST洗3次；依次進行固定（加入4%多聚甲醛4℃感作45 min，用PBST清洗3次）、穿透（用0.1% Triton-X100室溫感作15 min，用PBST清洗3次）、封閉（加入4% FBS，37℃封閉1 h）等步驟，棄掉封閉液，加入一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜。用PBST清洗3次加入1:200稀釋的二抗100L。室溫避光孵育1 h，清洗3次后，于熒光倒置顯微鏡中觀察。同時設未接種病毒的細胞作為陰性對照。

1.2.7 VP2基因克隆及遺傳進化分析 參照Genbank上登錄號為（GQ857614）的RDPV株的VP2基因序列，利用Primer 5.0軟件設計引物，擴增目的片段大小為1 755 bp，引物序列為R：ATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC（5′~3′），F：-TTAATATAATTTTCTAGGTGC TAGTTGAG（-5′~3′），PCR反應體系為50L：模板2L，2 LA Taq 25L，上、下游引物各1L，加ddH2O至總體積50L。PCR擴增中關鍵程序：退火30 （s55℃）；最后72℃延伸10 min。反應結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.8 克隆測序及遺傳進化分析VP2基因擴增后產物經膠回收后連接到Peasy-T1克隆載體上，轉化至DH-5感受態細胞并于含有氨芐青霉素的LB培養皿上37℃，180 r/min過夜培養。次日挑取單克隆菌落進行鑒定、擴大培養并提取陽性質粒，用限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定。將酶切鑒定正確的重組質粒送往吉林省庫美生物科技有限公司測序并進行拼接。登錄NCBI用BLAST選取與VP2基因序列相似性高的核苷酸序列進行同源性分析，用DNASTAR中的MegAlign程序對分離株VP2基因序列與GenBank發布的其他19株肉食獸細小病毒VP2基因序列進行分析并利用Mega7.0軟件用最大似然法（Maximum Likelihood）構建系統發育樹。

2 結果

2.1 病毒分離

正常細胞輪廓清楚，形態大小較均一；接種RDPVJL3毒株后的F81細胞，細胞變得腫大，呈拉網樣典型的病變，見圖1。

圖1 RDPV-JL3感染F81細胞的形態學觀察Fig.1 The morphology of F81 cells infected by the RDPVJL3

2.2 PCR鑒定

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在573 bp處出現特異性條帶，與預期目的條帶片段大小一致，見圖2。

圖2 RDPV-JL3 PCR鑒定結果Fig.2 The PCR-amplified form the RDPV-JL3

2.3 HA結果

RDPV-JL3第3代細胞病毒培養物的血凝效價保持在28以上。

2.4 TCID50結果

利用Reed-Muench法算得RDPV-JL3分離株的病毒含量為105.67 TCID 50/mL。

2.5 間接免疫熒光結果

熒光顯微鏡下分離毒株RDPV-JL3可見特異性綠色熒光；正常細胞對照未見特異性熒光，證實了該分離毒株為RDPV，見圖3。

圖3 RDPV-JL3的IFA結果Fig.3 The IFA result for the RDPV-JL3 strains of the parvovirus infected F81 cells

2.6 酶切鑒定

酶切鑒定與預期的目的條帶片段大小一致，見圖4。

圖4 RDPV-JL3基因重組質粒酶切鑒定結果Fig.4 The identification of the pEASY-T1-VP2 vector by restriction endonuclease digestion

2.7 VP2基因進化分析結果

將分離毒株RDPV-JL3 VP2序列與GenBank中公布的FPV、MEV、CPV和RDPV等19株肉食獸細小病毒VP2基因序列進行比對，通過對該株病毒與19個參考毒株VP2蛋白10個關鍵氨基酸位點進行比較分析，結果表明其80R、87M與FPV、MEV的氨基酸位點相同，根據其93N、103A、297S和426N位置氨基酸特性確定該株細小病毒屬于CPV-2株，未發現有S27T、S297A和I418T等氨基酸位點的同義替換，見表1。核苷酸進化樹分析結果表明，RDPV-JL3株與RDPV HeB10-3（登錄號KJ194463）及RDPV-17-JL-9（MH581183）株處于同一進化分支，與CPV-Vac1疫苗株親緣關系比較近，見圖5。

表1 RDPV-JL3株與GenBank中已知病毒的關鍵氨基酸比較Table 1 The comparison of key amino acids of known viruses between the RDPV-JL3 strain and GenBank

圖5 RDPV-JL3 VP2基因核苷酸序列的遺傳進化樹Fig.5 Phylogenetic relationships among 19 parvoviruses of carnivores isolates based on the nucleotide sequences of the VP2 gene

3 討論

細小病毒科是一種小的DNA病毒，具有線形單鏈DNA基因組，全長約5 kb，兩端有發夾結構。該病毒有兩個主要的開放閱讀框，一個編碼兩個非結構蛋白（NS1和NS2），另一個編碼衣殼蛋白VP1和VP2[15]。其中，VP2蛋白與病毒的致病性、毒力以及血凝特性密切相關。VP2蛋白上幾個關鍵氨基酸位點的改變就可以影響病毒的抗原性、宿主范圍和血凝特性，如VP2蛋白的aa77、aa88、aa370、aa375和aa377等位點發生突變后，細小病毒便失去血凝特性；aa426和aa297位的氨基酸特征是鑒定CPV-2變異株（CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b和CPV-2c）的關鍵因素[16,17]。1979 1980年，在美國，從狗身上發現了一種抗原性變異株，命名為CPV-2a。與原CPV-2不同的是VP2有5個氨基酸突變（Met87Leu、Ile101Thr、Ala300Gly、Asp 305 Tyr和Val 555 Ile）[18]，與此同時，另外兩個變異株CPV-2b（Asp 426）和CPV-2c（Glu 426）分別于1984年和1996年出現[19]。在過去的幾十年中，VP2蛋白Ser 297 Ala突變的CPV-2a和CPV-2b被命名為NewCPV-2a和NewCPV-2b[20]。

本試驗從貉腸道中成功分離出一株RDPV，經NCBI對其VP2基因序列進行BLAST分析表明，分離株RDPV-JL3與RDPV HeB10-3（KJ194463）相似性為100%，與RDPV-17-JL-9株相似性為99.94%。將其與Genbank上已公布的CPV分離株、CPV-Vac1疫苗株、RDPV分離株、FPV分離株和MEV分離株等19株已知毒株進行氨基酸同源性比較以及遺傳進化分析，結果發現所分離毒株與RDPV-17-JL-9株和CPVHeB10-3株的關鍵氨基酸位點一致，且根據103A、297S、300A和426N幾個關鍵氨基酸位點判定為CPV-2型。RDPV-JL3分離株與RDPV-17-JL-9分離株相比僅在S192F不一致，說明本次分離毒株與RDPV HeB10-3（KJ194463）和RDPV-17-JL-9株具有共同的起源；與同型的美國野生毒株CPV-b、CPV-d對比分析，在D375N位有突變，可能是地理因素造成的；與CPV-Vac1疫苗株相比，存在D375N、Q386K的突變，這是否對疫苗防疫失敗有影響還需要進一步深入研究。從系統進化樹上來看，RDPV-JL3與RDPV-17-JL-9株、CPVHeB10-3株處于同一進化分支并與CPV-Vac1疫苗株親緣關系比較近，推測可能是由于養殖場對犬使用犬細小病毒弱毒疫苗（CPV-2型）進行免疫，免疫后的犬持續性排毒，被CPV-2易感的貉子接觸感染發病[21]。