產(chǎn)茸相關(guān)SNP位點(diǎn)在7個(gè)梅花鹿群體中的驗(yàn)證

田雪琪，李洋，劉匯濤，王天驕，邢秀梅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130112）

2020年5月29日，以梅花鹿等16種特種畜禽列入《國(guó)家畜禽遺傳資源目錄》[1]。鹿茸作為傳統(tǒng)的中藥材在中國(guó)已有兩千多年的應(yīng)用歷史[2]，產(chǎn)茸性能一直是評(píng)估梅花鹿優(yōu)劣的重要指標(biāo)。梅花鹿的選種育種一直停留在常規(guī)表型選種階段，茸重、茸型、茸色和對(duì)稱(chēng)性是梅花鹿茸用品種培育的主要選種依據(jù)。分子標(biāo)記輔助選種仍處于起步階段，田萬(wàn)年等[3]對(duì)雙陽(yáng)梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）基因的研究，發(fā)現(xiàn)在824 bp處存在T→C突變，所產(chǎn)生的AB基因型個(gè)體的產(chǎn)茸性能顯著高于其他兩種基因型個(gè)體；杜智恒等[4]對(duì)東北梅花鹿生長(zhǎng)激素基因（GH）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在第2內(nèi)含子中存在G→A突變，這個(gè)SNP位點(diǎn)不同基因型可能對(duì)梅花鹿產(chǎn)茸性狀有影響，尤其是對(duì)第5鋸的產(chǎn)茸量有顯著影響趨勢(shì)；熊家軍[5]以?xún)蓚€(gè)地區(qū)梅花鹿種群作為研究對(duì)象，對(duì)褪黑素基因（MTNR1A）、生長(zhǎng)激素基因（GH）以及雄激素受體基因（AR）的SNPs與產(chǎn)茸量相關(guān)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在MTNR1A第2外顯子中存在G→C的位點(diǎn)突變，對(duì)湖北荊門(mén)五三梅花鹿種群產(chǎn)茸量具有顯著影響；GH基因139 bp處存在C→T突變對(duì)吉林東豐地區(qū)梅花鹿種群產(chǎn)茸量具有顯著影響；AR第3外顯子存在的C→T突變對(duì)兩個(gè)種群的產(chǎn)茸量均有顯著影響；陳斌[6]對(duì)梅花鹿轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1基因（TGF-1）的研究，發(fā)現(xiàn)在371 bp處的SNP位點(diǎn)存在3種基因型，其中AA基因型與其他兩種基因型的產(chǎn)茸量存在顯著差異。由此可見(jiàn)，在IGF-1、GH、MTNR1A、AR、TGF-1基因上均存在著與產(chǎn)茸量相關(guān)的SNP位點(diǎn)，且不同群體中與產(chǎn)茸相關(guān)的SNP位點(diǎn)存在一定差異，見(jiàn)表1。前期實(shí)驗(yàn)室在四平梅花鹿、東大梅花鹿兩個(gè)群體篩選得到8個(gè)與產(chǎn)茸性能相關(guān)的SNP位點(diǎn)。其中，SNP1427_255為極顯著相關(guān)，其余SNP位點(diǎn)為顯著相關(guān)。本試驗(yàn)應(yīng)用KASP分型技術(shù)在7個(gè)梅花鹿群體中進(jìn)行基因分型，并對(duì)不同基因型與產(chǎn)茸量做關(guān)聯(lián)分析，以探究東北梅花鹿產(chǎn)茸量相關(guān)基因型或SNP組合，為早期選種提供依據(jù)。

表1 各研究中與產(chǎn)茸相關(guān)SNP位點(diǎn)信息Table 1 The information of SNP locus in studies

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用雄性梅花鹿個(gè)體共計(jì)190頭，分別采集于吉林省遼源市東豐縣文福鹿場(chǎng)、吉林省通化市通化縣通化山寶鹿業(yè)、吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)東鰲鹿業(yè)、吉林省遼源市東豐縣鑫利達(dá)鹿業(yè)、吉林省梅河口市大成加隆畜禽有限公司、吉林省四平市吉梅花鹿種鹿場(chǎng)和吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)鹿業(yè)良種繁育有限公司。所有試驗(yàn)個(gè)體使用抗凝真空采血管采集頸靜脈血約10 mL，帶回實(shí)驗(yàn)室后﹣20℃保存，用于后續(xù)基因組DNA提取。同時(shí)記錄所有試驗(yàn)個(gè)體的原始產(chǎn)茸記錄，用于后續(xù)產(chǎn)茸性能關(guān)聯(lián)分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取使用天根生化科技（北京）有限公司所生產(chǎn)的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取試驗(yàn)樣品的基因組DNA，相關(guān)操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性；用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)DNA的濃度，確定基因組DNA質(zhì)量合格后，置于﹣20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 試驗(yàn)樣品Table 2 The samples submitted to this study

1.2.2 競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR分型技術(shù)本實(shí)驗(yàn)室提供8個(gè)SNP位點(diǎn)的序列信息，后續(xù)KASP分型實(shí)驗(yàn)中引物設(shè)計(jì)、合成及位點(diǎn)檢測(cè)均由北京康普森公司完成。該技術(shù)是根據(jù)對(duì)終端熒光信號(hào)的讀取對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行判斷，每孔反應(yīng)都是采用雙色熒光檢測(cè)1個(gè)SNP位點(diǎn)的2種基因型，不同的SNP對(duì)應(yīng)著不同的熒光信號(hào)。通過(guò)掃描試驗(yàn)用多重PCR板，采集不同的熒光信號(hào)得出檢測(cè)位點(diǎn)的具體信息。

1.2.3 產(chǎn)茸性能估測(cè)在實(shí)際生產(chǎn)中，由于鹿場(chǎng)的管理模式、養(yǎng)殖人員更換等因素，可能會(huì)造成某些個(gè)體的產(chǎn)茸記錄部分缺失。李和平等[7]建立了根據(jù)整個(gè)群體和個(gè)體產(chǎn)茸記錄來(lái)準(zhǔn)確估測(cè)公鹿產(chǎn)茸能力的數(shù)學(xué)模型，這個(gè)模型中假設(shè)存在一個(gè)包含若干頭公鹿的群體，其中第i頭公鹿有Ki次產(chǎn)茸記錄，則這頭公鹿i最有可能的產(chǎn)茸能力（Pi）為

其中P指鹿群鋸平均產(chǎn)茸量；t指同一公鹿不同鋸別產(chǎn)茸記錄之間的相關(guān)（重復(fù)力）；Xi指公鹿的鋸平均產(chǎn)茸量。本試驗(yàn)根據(jù)這個(gè)模型對(duì)試驗(yàn)個(gè)體進(jìn)行產(chǎn)茸能力估測(cè)。

1.2.4 SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)群體遺傳學(xué)的研究方法，運(yùn)用Cervus軟件對(duì)群體的遺傳參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，其中包括基因頻率、基因型頻率、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）和哈迪-溫伯格（H-W）平衡檢驗(yàn)等[8]，同時(shí)運(yùn)用SPSS19.0軟件，采用一般線(xiàn)性模型對(duì)遺傳信息與產(chǎn)茸性能的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行最小二乘法分析。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取

將所提取的基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000進(jìn)行基因組DNA完整性、純度和濃度檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，電泳條帶單一且清晰明亮，大小位于15 000 kb Marker頂端條帶之上；Nano-Drop2000檢測(cè)結(jié)果顯示，所提取的DNA濃度在50~100ng/L，OD值介于1.8~2.0之間，紫外吸收峰峰型正常。

圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Genomic DNA agarose gel electrophoresis

2.2 引物設(shè)計(jì)結(jié)果及相關(guān)信息

應(yīng)用Primer 5軟件，對(duì)8個(gè)位點(diǎn)所在序列進(jìn)行分析，經(jīng)過(guò)篩選得出最適引物。本試驗(yàn)中所用8個(gè)SNP位點(diǎn)的引物序列及相關(guān)信息見(jiàn)表3。

表3 SNP位點(diǎn)引物信息Table 3 The information of SNP’s primer

2.3 SNP位點(diǎn)分型結(jié)果

運(yùn)用KASP技術(shù)，對(duì)190個(gè)樣本的8個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型。研究表明，用于表型關(guān)聯(lián)分析的位點(diǎn)，基因型檢出率不低于94%[9]。本研究對(duì)8個(gè)SNP位點(diǎn)檢出率情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，位點(diǎn)的檢出率介于95.26%~98.42%，平均檢出率為97.43%，均大于94%，全部分型成功。同時(shí)還對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行最小等位基因頻率（MAF）計(jì)算分析，平均MAF值為0.188，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 SNP位點(diǎn)MAF值計(jì)算結(jié)果Table 4 The calculated results of MAF value of SNP locus

2.4 群體遺傳多樣性分析

運(yùn)用KASP對(duì)8個(gè)SNP位點(diǎn)在驗(yàn)證群體進(jìn)行基因分型，所得到的基因型信息使用Cervus軟件計(jì)算。通過(guò)得到的基因型信息對(duì)該群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表5。8個(gè)SNP位點(diǎn)中，有7個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，其多態(tài)信息含量（PIC）介于0.078~0.369，平均值為0.231 6；最小基因等位基因頻率（MAF）介于0.044~0.396之間，平均值為0.188；各位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度（Ho）介于0.090~0.426，平均值為0.265；期望雜合度（He）為0.082~0.490，平均值為0.282；有效等位基因數(shù)（Ne）介于1.2~2.8，平均值為1.9。觀測(cè)雜合度與期望雜合度不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（P＞0.05）。Hardy-Weinberg平衡分析結(jié)果顯示，SNP614_2585、SNP1881_130和SNP596_3774這3個(gè)SNP位點(diǎn)顯著偏離平衡（P＜0.05）。

表5 群體中9個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)信息Table 5 The genetic parameter information of 9 SNP locus in the population

2.5 產(chǎn)茸性能估測(cè)結(jié)果

運(yùn)用茸重估測(cè)模型，計(jì)算驗(yàn)證群體中每個(gè)個(gè)體的產(chǎn)茸估測(cè)值。計(jì)算結(jié)果顯示，試驗(yàn)群體的產(chǎn)茸估測(cè)值介于1.12~8.55 kg。對(duì)所有個(gè)體的產(chǎn)茸估測(cè)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)相關(guān)研究，將產(chǎn)茸估測(cè)值分大于3.5 kg的高產(chǎn)組和小于2.5 kg的低產(chǎn)組[10]。對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示兩組產(chǎn)茸估測(cè)數(shù)據(jù)存在極顯著差異（P＜0.01），證明本群體中存在高、低產(chǎn)個(gè)體。部分樣本的產(chǎn)茸記錄和估測(cè)值，見(jiàn)表6。

表6 部分梅花鹿產(chǎn)茸性能估測(cè)Table 6 The estimation of the antler performance

2.6 SNP位點(diǎn)與產(chǎn)茸性狀的關(guān)聯(lián)分析

對(duì)190頭梅花鹿進(jìn)行產(chǎn)茸性狀與SNP標(biāo)記相關(guān)性分析。經(jīng)過(guò)計(jì)算，7個(gè)SNP位點(diǎn)的相關(guān)性P值介于0.264~0.849之間，均大于0.05，顯示所有位點(diǎn)SNP位點(diǎn)與產(chǎn)茸性狀均不存在顯著相關(guān)性（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 SNP位點(diǎn)關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果Table 7 The phenotypic interpretation rate of SNP Locus

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果顯示，位點(diǎn)SNP219_9123所有個(gè)體基因型均為CC，無(wú)多態(tài)性。SNP1427_255、SNP307_1564、SNP123_7847、SNP2027_423、SNP614_2585和SNP596_3774均存在3種基因型，但各基因型所占比例不同。SNP1881_130中僅存在兩種基因型，CC和CT，其中CC為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.91。SNP1427_255中，純合CC為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.56。SNP307_1564中，純合GG為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.63。SNP123_7847中，純合TT為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.56。SNP2027_423中，雜合AG為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.43。SNP614_2585中，純合AA為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.87。SNP596_3774中，純合TT為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.82。對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)不同基因型的產(chǎn)茸性估測(cè)值均值進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示，各位點(diǎn)的不同基因型間產(chǎn)茸估測(cè)值均值不存在顯著差異。進(jìn)一步驗(yàn)證了8個(gè)SNP位點(diǎn)在本驗(yàn)證群中與產(chǎn)茸性能不存在顯著相關(guān)性。但在SNP307_156、SNP614_258和SNP596_377位點(diǎn)具有明顯的高產(chǎn)基因型。在SNP307_156中，存在與已知研究相同的高產(chǎn)CC基因型[11]，分別高于CG基因型和GG基因型14.36%和17.85%。在該位點(diǎn)中，對(duì)具有CC基因型個(gè)體的產(chǎn)茸值與CG基因型和GG基因型個(gè)體進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組產(chǎn)茸量具有顯著差異性（P＜0.05）。還發(fā)現(xiàn)SNP614_258位點(diǎn)高產(chǎn)基因型為GG，SNP596_377位點(diǎn)高產(chǎn)基因型為CC。具體位點(diǎn)詳細(xì)信息見(jiàn)表8。

表8 多態(tài)性位點(diǎn)的基因型信息Table 8 The genotype information of the polymorphic locus

3 討論

根據(jù)群體遺傳學(xué)的研究方法，運(yùn)用Cervus軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）、平均期望雜合度（He）、觀測(cè)雜合度（Ho）和Hardy-Weinberg群體平衡，以分析群體遺傳多樣性。多態(tài)信息含量這一指標(biāo)是由Botsticn等[12]在1980年提出，該參數(shù)的高低用以描述家系連鎖分析標(biāo)志基因（或標(biāo)志序列）的多態(tài)性大小。Botsticn認(rèn)為，當(dāng)多態(tài)信息含量大于0.5時(shí)，該標(biāo)志基因具有高度信息含量，小于0.5而大于0.25則為中度信息含量，小于0.25時(shí)具有低度信息含量。本試驗(yàn)中所驗(yàn)證的7個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）介于0.078~0.369，其中SNP614_2585、SNP1881_130和SNP596_3774為低度多態(tài)性位點(diǎn)，SNP1427_255、SNP307_1564、SNP123_7847和SNP2027_423為中度多態(tài)性位點(diǎn)，沒(méi)有高度多態(tài)性位點(diǎn)。相關(guān)研究表明，與微衛(wèi)星標(biāo)記相比，SNP的多態(tài)性較低，但因SNP位點(diǎn)為全基因組層面內(nèi)分布，可在一定程度上彌補(bǔ)其相較于微衛(wèi)星等其他分子標(biāo)記方法中多態(tài)性較低的問(wèn)題，使得SNP位點(diǎn)可用于相關(guān)性狀分析[13]。

雜合度用來(lái)評(píng)價(jià)群體在檢測(cè)位點(diǎn)上出現(xiàn)雜合的頻率，是評(píng)價(jià)群體遺傳變異的重要參數(shù)。通過(guò)對(duì)比觀測(cè)雜合度（Ho）和期望雜合度（He）的相對(duì)大小來(lái)判定群體近交程度。當(dāng)觀測(cè)雜合度小于期望雜合度時(shí)，群體遺傳多樣性低，為近親繁殖；當(dāng)兩者相等時(shí)，群體內(nèi)個(gè)體為隨機(jī)交配；當(dāng)觀測(cè)雜合度大于期望雜合度，群體遺傳多樣性較高，為遠(yuǎn)親繁殖。本試驗(yàn)群體的平均觀測(cè)雜合度（Ho）為0.265，平均期望雜合度（He）為0.282，呈觀測(cè)雜合度略小于期望雜合度，表明群體雜合度低，群體遺傳多樣性低。

Hardy-Weinberg平衡是以完全隨機(jī)交配所組成的自然種群為基礎(chǔ)而做出的假設(shè)。因此，通過(guò)Hardy-Weinberg群體平衡卡方檢測(cè)來(lái)衡量群體遺傳平衡狀態(tài)。本研究群體經(jīng)過(guò)Hardy-Weinberg群體平衡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在具有多態(tài)性的7個(gè)位點(diǎn)中，有3個(gè)位點(diǎn)顯著偏離平衡狀態(tài)。現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，在小規(guī)模種群中，近親交配和無(wú)效等位基因等因素會(huì)導(dǎo)致雜合度不足，造成位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡[14]。所以這3個(gè)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡的位點(diǎn)可能與群體遺傳多樣性低、人工選育干預(yù)強(qiáng)度大的情況有關(guān)。東北地區(qū)的家養(yǎng)梅花鹿均為野生東北梅花鹿的后裔，結(jié)合本研究群體的多個(gè)遺傳信息結(jié)果可以看出，東北地區(qū)各梅花鹿種群間的遺傳背景十分相似。

本試驗(yàn)是對(duì)已知與產(chǎn)茸量相關(guān)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。在試驗(yàn)群體中，這些SNP位點(diǎn)與本群體中的產(chǎn)茸量不存在顯著相關(guān)性。推測(cè)其原因，可能是由于在篩選群體中，主要是以四平梅花鹿和東大梅花鹿為主。這兩個(gè)品種的梅花鹿在已知品種中為高產(chǎn)品種。特別是東大梅花鹿群體，在產(chǎn)茸性能方面極顯著高于四平梅花鹿和其他群體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，東大梅花鹿和四平梅花鹿的上鋸三杈鮮茸平均單產(chǎn)為4 kg和3.42 kg，明顯高于其他品種，如雙陽(yáng)梅花鹿上鋸三杈鮮茸單產(chǎn)為2.9 kg[15]，敖東梅花鹿上鋸三杈鮮茸單產(chǎn)為3.34kg[16]。究其原因可能與東大梅花鹿在育種期間引入馬鹿血源及高強(qiáng)度人工選擇有關(guān)[11]。本研究中的190頭梅花鹿群體經(jīng)全基因組SNP鑒別芯片檢測(cè)，判定為純種梅花鹿，純種梅花鹿在產(chǎn)茸量方面較雜交個(gè)體相差甚遠(yuǎn)。因此，我們推測(cè)群體遺傳背景差異可能是造成與產(chǎn)茸相關(guān)性SNP位點(diǎn)在本試驗(yàn)中不相關(guān)的主要原因。后續(xù)對(duì)梅花鹿產(chǎn)茸性能相關(guān)的SNP位點(diǎn)的篩選，建議擴(kuò)大篩選群體，增加群體數(shù)量。在表型數(shù)據(jù)中，除依據(jù)產(chǎn)茸估測(cè)之外，還可以通過(guò)相同鋸齡的實(shí)際產(chǎn)茸量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為吉林梅花鹿的產(chǎn)茸性能SNP位點(diǎn)提供有效參考。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR分型技術(shù)對(duì)190個(gè)個(gè)體的8個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測(cè)，得出7個(gè)具有多態(tài)性的SNP位點(diǎn)。使用一般線(xiàn)性模型對(duì)這7個(gè)SNP位點(diǎn)遺傳信息與產(chǎn)茸量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在本試驗(yàn)中所建立的隨機(jī)驗(yàn)證群體中，所有SNP位點(diǎn)與產(chǎn)茸量均不存在顯著關(guān)聯(lián)，但存在SNP307_156、SNP614_258和SNP596_377位點(diǎn)具有明顯的高產(chǎn)基因型。本研究表明，前期基于部分群體篩選出的與產(chǎn)茸量相關(guān)SNP位點(diǎn)在本試驗(yàn)群體的適用性不理想。