基于網絡藥理學和分子對接研究山慈菇對肺癌的作用機制

錢薇，褚明亮，劉杰民

（1.貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴州 貴陽550025；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科，貴州 貴陽550001；3.貴州省人民醫院消化內鏡科室，貴州 貴陽550002）

肺癌即原發性支氣管肺癌，主要病變于支氣管黏膜上皮及肺泡，是我國及世界范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。現階段肺癌治療多以手術切除和放化療為主，存在預后較差及復發可能性大等一系列問題。我國最早于《晉書》中有對癌癥手術治療的記載，歷代醫家認為氣滯血瘀、痰結濕聚、熱毒聚集而至腫塊結節于肺是肺癌發生的病因。研究表明山慈菇可以化痰之功效解肺之腫塊[1]。

山慈菇為蘭科植物杜鵑蘭[Cremastra appendiculata(D.Don)Makino]、獨蒜蘭[Pleione bulbocodioides(Franch.)Rolfe]或云南獨蒜蘭（Pleione yunnanensis Rolfe）的干燥假鱗莖。山慈菇性涼，味微辛、甘，具有清熱解毒、化痰軟堅散結等功效?，F代臨床用于內、外、婦、兒、五官以及皮膚等疾病的治療，尤其在治療各類腫瘤方面效果顯著[2]。周仲瑛[3]指出，山慈菇主要作用為化痰散結，中醫認為肺癌是由于痰濁較盛、結聚成塊于肺而成，故用山慈菇可化其痰解結節。山慈菇化學成分主要有多糖、二氫菲類、聯芐類、甾類、黃酮類以及其他類化合物[4]。藥理學研究表明山慈菇具有抗腫瘤、降壓、抗菌、激活酪氨酸酶和毒覃堿M3受體阻斷等活性[5]。山慈菇通過細胞毒作用、抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡和抑制腫瘤新生血管生成等方面抑制癌細胞生長繁殖[6]。目前山慈菇的抗癌作用研究較為局限，其具體的藥效物質基礎及作用機制鮮有報道，因此在網絡藥理學和分子對接基礎上分析山慈菇的抗癌作用機制，可為其臨床應用研究提供部分科學依據。

1 材料與方法

1.1 軟件與數據庫

UniProt蛋白數據庫（https://www.uniprot.org/），中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php），DrugBank數據庫（http://www.drugbank.ca/），Cytoscape 3.7.1軟件（https://cytoscape.org/），V2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）GeneCard數據庫（https://www.genecards.org/），Stringdb數據庫（https://stringdb.org/）、Metascape數據庫（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）、PDB數據庫（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do ）、PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 山慈菇活性成分的篩選

通過TCMSP數據庫收集山慈菇的化學成分，時間截至2020年11月，并依據TCMSP數據庫的口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%和類藥性指數（drug like index,DL）≥0.18為篩選條件[7,8]，獲得山慈菇的有效活性化合物，并利用Uniport數據庫進行基因標準化核對，把相應靶點蛋白名稱轉化為對應的基因名稱。

1.3 山慈菇活性成分-靶點網絡的構建

通過TCMSP數據庫收集“1.2”項下山慈菇中的活性成分的對應靶點，利用Cytoscape3.7.1軟件構建“活性成分-靶點”網絡圖。

1.4 肺癌靶點信息的篩選

在Genecard數據庫中輸入關鍵詞“lung cancer”，由于獲得相關靶點過多且有部分靶點與肺癌關聯分數所以通過Excel篩選關聯分數列中位數的方式，篩選4次后獲得最適中位數12.43，之后通過Relevance score≥12.775對所得靶點進行篩選，得到GeneCards數據庫肺癌相關靶點信息；在Drugbank數據庫中輸入關鍵詞“lung cancer”進行搜索，得到Drugbank數據庫肺癌相關靶點信息。將以上兩個數據庫篩選后獲得的靶點信息進行合并去重。

1.5 山慈菇活性成分靶點和肺癌疾病靶點的可視化網絡數據圖

運用Unitprot數據庫對“1.3”項和“1.4”項所得蛋白質靶點數據進行標準化，采用VENNY 2.1對山慈菇活性成分作用靶點與肺癌疾病靶點進行交集，然后運用Cytoscape 3.7.1軟件構建山慈菇活性成分靶點和肺癌疾病靶點的可視化網絡數據圖。

1.6 山慈菇治療肺癌疾病靶點蛋白互作網絡構建

在STRING11.0數據庫中上傳“1.5”項山慈菇活性成分作用靶點與肺癌疾病靶點的交集靶點，獲得靶點預測蛋白與蛋白之間相互作用的關系。在設置中選取蛋白間最低互作得分>0.700作為蛋白之間相互作用的信度依據，并隱藏網絡聯結外的節點，最終得到了蛋白相互作用的網絡圖。

1.7 GO和KEGG通路富集分析

使用Metascape數據庫對“1.5”項中得到的抗癌靶點進行GO和KEGG生物通道富集分析，篩選出癌癥相關通路；并利用Cytoscope 3.7.1軟件，構建“靶點-KEGG通路”網絡。

1.8 分子對接驗證

在PDB數據庫中檢索并下載互作靶點蛋白3D圖，并在PubChem數據庫中下載3個主要化合物的2D結構，利用Chem3D進行優化。利用PyMOL 2.4.0軟件對化合物進行除水、去除原配體，最后運用Auto-Dock的可視化軟件進行分子對接。

2 結果與分析

2.1 山慈菇的活性成分的篩選

傳統中藥多為口服，在人體中的吸收（Absorption）、分布（Distribution）、代謝（Metabolism）和外排（Excretion），即ADME，是傳統口服中藥必然經歷的人體代謝過程。OB和DL是ADME系統的2個主要性能指標，其中OB值≥30，DL≥0.18作為中草藥類藥化合物的篩選標準，篩選出了3個符合條件的山慈菇的活性化合物。查閱相關文獻獲得3個經實驗證實的活性化合物，分別為乙酸乙酯（Ethyl acetate）[9]、秋水仙堿（Colchicine）[10]和正丁醇（N-butanol）[11]，見表1。

2.2 山慈菇活性成分-靶點網絡的構建

通過TCMSP數據庫以及相關文獻收集山慈菇中的6個活性成分的對應靶點，共獲得105個藥物靶點蛋白。利用Uniport數據庫檢索105個靶點蛋白的對應基因名并進行標準化檢索，其中9個蛋白Heat shock protein HSP 90、mRNA of PKA Catalytic Subunit C-alpha、5-hydroxytryptamine 2A receptor、Ig gamma-1 chain C region、Aldose reductase、Thrombin和Cell division protein kinase 2、Alcohol dehydrogenase 1B、Cytochrome P450-cam、2-hydroxy-6-oxo-7-methylocta-2,4-dienoate hydrolase未找到對應基因名稱，7個蛋白Cytochrome P450-cam、Cytochrome P450-cam、Ferrichrome-iron receptor、Monomeric sarcosine oxidase、Bacillolysin、Haloalkane dehalogenase、Haloalkane dehalogenase的對應基因為非人源基因，除去重復基因，最后共獲得68個藥物靶點蛋白對應基因，見圖1。

圖1 山慈菇活性成分-靶點圖Fig.1 The active ingredient-target figure of Cremastra appendiculata

2.3 山慈菇藥物靶點-肺癌靶點網絡構建

在GeneCards數據庫中共獲得23 108個與肺癌相關的基因和靶點信息，經Relevance score≥12.775篩選后獲得2 115個與肺癌相關的基因和靶點信息。在Drugbank數據庫中收集了148個與肺癌相關的基因和靶點信息。將兩個數據庫的基因合并后除去35個重復基因，共獲得1020個與肺癌相關的基因和靶點信息，見圖2。運用Unitprot數據庫對68個山慈菇藥物靶點蛋白和1 020個肺癌相關所得蛋白靶點數據進行標準化，采用在線韋恩獲得山慈菇藥物靶點與肺癌疾病靶點共有靶點32個，見圖2和圖3。

圖2 山慈菇的藥物-癌癥靶點韋恩圖Fig.2 Cancer-drug targets Venn diagram of Cremastra appendiculata

2.4 山慈菇活性成分靶點和肺癌靶點網絡數據圖

利用Cytoscope 3.7.1軟件構建山慈菇活性成分靶點和肺癌靶點網絡數據圖，見圖3。顯示共39個節點（5個化合物節點，1個疾病節點，1個藥物節點，32個靶點節點）和80條邊。其中紅色節點代表山慈菇，黃色節點代表肺癌疾病，紫色節點代表有效活性成分節點，綠色節點代表目標靶點節點，黑色的線條代表有效活性成分與目標靶點之間相互作用關系。網絡圖中的節點的度值表現其與其他節點的相連性，節點的度值與節點的關鍵性成正比。其中-谷甾醇（beta-sitosterol）的度值（degree）最高，為34，見圖3。由圖觀察可知正丁醇（N-butanol）的相關藥物靶點與肺癌靶點無交集靶點。

圖3 山慈菇活性成分靶點和癌癥靶點網絡圖Fig.3 The active ingredients-targets network map and cancer-targets network data graph of Cremastra appendiculata

2.3 山慈菇作用肺癌靶點蛋白互作網絡構建

在STRING數據庫中上傳32個肺癌-藥物共同靶點，并設置蛋白參數評分值＞0.400，由此獲取相應蛋白互相作用信息。將網絡信息TSV數據格式導入Cytoscope 3.7.1軟件構建各蛋白互相作用的PPI網絡后，進行拓撲分析，其中CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、MAPK14、PIK3CA和CASP8等基因的節點度值為12，明顯高于其他靶點，見圖4。

圖4 山慈菇治療癌癥疾病靶點蛋白互作PPI圖Fig.4 The treatment of cancer diseases targeted protein interactions PPI figure of Cremastra appendiculata

2.4 互作靶點基因的KEGG通路和GO富集化分析

使用Metascape數據庫進行富集化分析，將32個肺癌-藥物共同靶點進行KEGG通路分析，共獲得15條信號通路，具體見表2和圖5。使用Cytoscope 3.7.1軟件，連接各基因信號通路，構建出“成分-靶點-通路”網絡圖見圖6。從網絡圖中可以發現32個靶點以及15條通路之間有密切的相互關聯作用。其中的癌癥通路（Pathways in cancer）和雌激素信號通路（Hepatitis B）與靶點的相互關聯最多，分別為16個和11個（圖6），且只有4個活性成分存在靶點通路，分別為-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、2-甲氧基-9,10-二 氫 菲-4,5-二 醇（2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-4,5-diol）和秋水仙堿（Colchicine）。

圖5 KEGG通路富集化分析氣泡圖Fig.5 The enrichment pathway analysis diagram

圖6 “成分-靶點-通路”網絡圖Fig.6 The“components-targets-pathways”network diagram

表2 山慈菇治療靶點相關通路信息Table 2 Therapeutic targets related pathways of Cremastra appendiculata

在Metascape數據庫中將32個肺癌-藥物共同靶點進行靶點GO富集化分析，互作靶點與19個分子功能（Molecular Functions）相關，篩選其中count值≥10的分子功能（count值越大代表靶點與某個生物過程的相關性越大）；與20個生物過程（Biological Processes）相關，篩選其中count值≥15的生物過程；與9個細胞組分（Cellular Components）相關（圖7）。其中分子功能富集在與神經遞質受體活性（neurotransmitter receptor activity）、G蛋白偶聯的胺受體活性（G protein-coupled amine receptor activity）、乙酰膽堿受體活性（acetylcholine receptor activity）、蛋白質結構域特異性結合（protein domain specific binding）、轉錄因子結合（transcription factor binding）、內肽酶活性（endopeptidase activity）、蛋白質均二聚活性（protein homodimerization activity）、金屬離子跨膜轉運蛋白活性（metal ion transmembrane transporter activity）、蛋白激酶結合（protein kinase binding）和磷酸轉移酶活性（phosphotransferase activity）上等；生物過程主要富集在血液循環（blood circulation）、化學突觸傳遞（chemical synaptic transmission）、細胞對有機環狀化合物的反應（cellular response to organic cyclic compound）、對有毒物質的反應（response to toxic substance）、神經遞質水平的調節（regulation of neurotransmitter levels）、細胞對氮化合物的反應（cellular response to nitrogen compound）、有節奏的過程（rhythmic process）、有機羥基化合物轉運（organic hydroxy compound transport）、發育增長的調節（regulation of developmental growth）、MAPK級聯反應的正調控（positive regulation of MAPK cascade）及蛋白質定位建立的調控（regulation of establishment of protein localization）上等；細胞組分主要富集在突觸后膜（postsynaptic membrane）、膜筏（membrane raft）、突觸前膜的組成部分（integral component of presynaptic membrane）、細胞器外膜（organelle outer membrane）、多巴胺能突觸（dopaminergic synapse）、血液微粒（blood microparticle）、核包膜（nuclear envelope）、谷氨酸能突觸（glutamatergic synapse）和三級顆粒（tertiary granule）上。

圖7 GO功能富集分析圖Fig.7 The GO function enrichment analysis chart

2.5 分子對接

將-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、2-甲氧基-9,10-二氫菲-4,5-二醇（2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-4,5-diol）和秋水仙堿（Colchicine）4個藥物活性成分與CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、MAPK14、PIK3CA及CASP8等交集靶點逐一進行對接，配體與受體可自發結合的結合能指標均小于0，兩者的結合能越小，其結合構象越穩定。當結合能≤﹣17.79 kJ/mol時，說明有一定結合活性；當結合能≤﹣20.93 kJ/mol時，說明有較好結合活性；當結合能≤﹣29.30 kJ/mol時，說明有強的結合活性[12]。本研究運用PyMOL 2.4.0軟件和AutoDock的可視化軟件進行對接（表3），然后選取結合能＜﹣33.93 kJ/mol作為篩選條件并將其對接結果繪制為3D示意圖（圖8）。除結合能外，分子對接的氫鍵也是分子對接的柔性程度的重要指標，如圖8所示，圖8 B與圖8 C中均有氫鍵（黃色虛線）。綜上分析豆甾醇和2-甲氧基-9,10-二氫菲-4,5-二醇可能為山慈菇治療肺癌的關鍵活性成分。

圖8 山慈菇活性成分與靶蛋白對接三維圖（結合能≤-33.49 kJ/mol）Fig.8 The three-dimensional diagram of the docking between the active ingredients of Cremastra appendiculata and the target proteins(binding energy≤-33.49 kJ/mol)

表3 山慈菇活性成分與靶點結合能Table 3 The binding energy of active ingredients of Cremastra appendiculata to the target

3 討論

隨著我國醫學事業的不斷進步以及互聯網行業的崛起，藥物信息學發展迅速，網絡藥理學作為一個新型學科把藥物與疾病相結合探究疾病、藥物與靶點之間的相互作用，從而揭示了中藥中多成分-多靶點的作用關系[7,8]。中藥具有多成分、多靶點的特點，利用網絡藥理學方法探究中藥的有效活性成分及其與各疾病靶點的相互作用，可為下一步的研究提供一定的參考[7,8,13]。

研究通過TCMSP數據庫挖掘，篩選得到山慈菇的4個有效活性成分，包括-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、2-甲氧基-9,10-二氫菲-4,5-二醇（2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-4,5-diol）和秋水仙堿（Colchicine）。其中-谷甾醇（beta-sitosterol）的度值（degree）最高，為34（圖3），說明-谷甾醇與34個靶點蛋白相互作用，該化合物可能為山慈菇治療癌癥疾病的重要化合物。研究表明，-谷甾醇具有多種藥理作用，如降血脂、抗炎及抗癌作用[14-16]。-谷甾醇在對抗肺癌、乳腺癌、前列腺癌和結腸癌等方面具有重要作用[17]。-谷甾醇可抑制癌細胞系鞘磷脂周期的激活，阻滯細胞周期以及刺激凋亡細胞死亡[15]，影響細胞周期從而抑制癌癥細胞的過度增殖，抑制癌癥細胞的增生和分化，誘發癌癥細胞凋亡[18,19]。-谷甾醇可抑制瘤體中血管內皮細胞生長因子（VEGF）的異常升高，抑制新生血管的異常生成，抑制腫瘤的生長[20]，且分子對接結果表明，-谷甾醇對MAPK14和PIK3CA均有較好的結合活性，但其在結合過程中無氫鍵連接，實際結合情況可能存在較大差異。而2-甲氧基-9,10-二氫菲-4,5-二醇和豆甾醇與CASP3、JUN、PTGS2、MAPK14和PIK3CA均有結合活性且結合過程中存在多個氫鍵連接。因豆甾醇為植物基礎化合物，在大部分植物中均含有，所以其不具有獨特性。綜上，可猜測2-甲氧基-9,10-二氫菲-4,5-二醇為山慈菇治療肺癌的關鍵化合物，由于現階段對此化合物研究較少，所以2-甲氧基-9,10-二氫菲-4,5-二醇是否能發揮其抗癌效用還需進一步實驗證實。

PPI蛋白互作網絡表明，CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、MAPK14、PIK3CA和CASP8等基因的節點度值＞12，明顯高于其他靶點見圖5，說明上述靶點可能是山慈菇治療肺癌的核心潛在靶點。CASP3是重要的凋亡信號分子，其在肺癌組織中有顯著性差異的升高表達[21]。JUN參與多種信號通路，調控肺癌、胃癌等腫瘤細胞的增殖、凋亡[22,23]。ESR1基因是雌激素受體1基因，其單核苷酸多態性與多種腫瘤，特別是乳腺癌的內分泌治療效果密切相關[18]。PTGS2是前列腺素內環氧化物合成酶2，此基因為誘導性即刻反應基因，在人體正常生理狀態下不表達，但在炎癥和腫瘤因子的刺激下表達上調，其用作調控腫瘤細胞的重要指標[24]。MAPK14是絲裂原活化蛋白激酶14，為MAPK3個主要亞家族中的一員，是VEGF通路的重要靶點，其激活可促進癌細胞的凋亡或抑制癌細胞的增殖，被稱為腫瘤抑制因子[25,26]；PIK3CA是常見的原癌細胞之一，主要作用機制為活化PI3Ks以此促進腫瘤細胞的活化、細胞間的黏附以及增殖[27]；CASP8是半胱天冬酶8基因，CASP8為CASP家族中的一個重要亞基，CASP基因在生物體中的作用是維持基因相互作用和信號的調控，在誘導細胞內外途徑凋亡上發揮著重要作用[28]。

對交集靶點進行GO分析和KEGG分析進一步探究山慈菇對肺癌的發生機制。結果表明，山慈菇通過對血液循環、化學突觸傳遞、對有毒物質的反應、神經遞質水平的調節、發育增長的調節和MAPK級聯反應的正調控等生物過程及在G蛋白偶聯的胺受體活性、乙酰膽堿受體活性、蛋白質結構域特異性結合、轉錄因子結合和蛋白激酶結合等分子反應上，進而調控癌癥通路（Pathways in cancer）和雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）等發揮山慈菇對肺癌細胞的抑制作用。雌激素信號通路主要通過與ER受體的結合啟動膜ER信號通路，從而激活ER和ER對癌細胞的抑制作用，同時也可激活PI3K或MAPK信號通路從而達到對肺癌細胞的抑制性作用[29]，且CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、MAPK14、PIK3CA、CASP8等關鍵靶點均富集在此通路上，由此可知山慈菇和肺癌疾病及雌激素的調節均相關，也許這就是山慈菇對肺癌有較好治療效果的分子機理[30-32]。

4 結論

該研究在網絡藥理學和分子對接的方法多成分、多靶點、多通路地對山慈菇進行了復雜的網絡關系探究，研究結果與相關文獻報道基本吻合，初步分析了山慈菇的作用機制和藥理作用，為進一步的探究提供了良好的基礎，指明了山慈菇中2-甲氧基-9,10-二氫菲-4,5-二醇等潛在有效成分，作用于CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、MAPK14、PIK3CA和CASP8等多個靶點，并通過癌癥通路、雌激素通路等參與外在細胞凋亡、有效蛋白激活及氧化應激反應等發揮山慈菇對肺癌的治療作用。但該研究還存在一定局限性，由于中藥多口服，所以藥物服用后在不同人體中實際發揮的藥效作用與網絡分析中篩選的活性化學成分以及作用效果不盡相同，因此下一步還需要具體實驗對其研究結果進一步證實。