金花小檗種子總黃酮的優化提取及抗氧化活性

尚志福，鄭友琪，張濟顯，位竹君，張北方，張瑩

（東北林業大學化學化工與資源利用學院，黑龍江 哈爾濱150040）

金花小檗（Berberis wilsonae Hemsl.）為小檗科（Berberidaceae）小檗屬植物，產于我國云南、四川、貴州、西藏和陜西。金花小檗根枝入藥可代黃連用，具有清熱、解毒和消炎的功效，用于止痢、赤眼紅腫等，也可用為飲料資源[1,2]，小檗屬植物三顆針為我國藥典收錄藥材[3]。研究表明，小檗屬植物含多種小檗堿類、酚酸類、黃酮類和有機酸類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗驚厥、降血壓、改善記憶和抑菌等多種藥理作用[4-8]。黃酮類化合物作為重要植物的次生代謝物，具有抗氧化等多種生物活性，在飲料等食品加工領域具有廣闊應用前景[9-11]。目前，國內外對小檗屬植物的研究主要集中于根莖中的小檗堿類成分，對其他部位的研究相對較少，其中吳莉莉等[12]對產自黑龍江伊春的細葉小檗葉進行了總黃酮測定，65%乙醇提取物的總黃酮含量可達0.513%；李金輝等[13]對采自貴州六盤水的威寧小檗根、莖、葉進行了黃酮類化合物的含量測定和抗氧化活性研究，結果表明威寧小檗葉中的黃酮含量高達126.22 mg/g，且抗氧化活性最好；買爾旦·玉蘇甫等[14]對購自新疆維吾爾自治區喀什地區的喀什小檗果實研究表明，喀什小檗果實水提物具有非內皮依賴性的舒張血管作用。金花小檗果實因相關研究開展較少使其應用受到限制。目前，小檗屬植物種子的研究多集中于發芽及幼苗更新[15-17]，關于金花小檗種子的化學和藥理學研究亦未見報道。本研究以乙醇為提取溶劑，應用超聲輔助技術提取金花小檗種子中的總黃酮，在考察功率、體積分數、料液比、溫度和超聲時間等單因素對總黃酮提取得率影響的基礎上，采用響應面（RSM）設計進行提取參數的優化，從而得到最佳提取工藝；再對金花小檗提取物的體外抗氧化活性進行測定，從而為我國小檗屬植物的深入開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

金花小檗成熟果實于2020年10月采自西藏自治區林芝市八一鎮，室溫陰干至恒重后，經手工分離獲得金花小檗種子；2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、2,2'-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2,4,6-三（2-吡啶）-1,3,5-三嗪（TPTZ）、2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）、水溶性維生素E（Trolox）購自美國西格瑪奧德里奇公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

JP-100ST超聲波清洗機（深圳潔盟清洗設備有限公司）；H1650醫用離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；752N紫外-可見分光光度計（上海精科實業有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮提取將干燥的金花小檗種子粉碎并過60目篩備用。取0.1 g金花小檗種子粉末，以不同體積分數乙醇為提取溶劑，采用超聲輔助法提取總黃酮，提取結束后經離心（10 000 r/min，10 min），吸取上清液備用?？傸S酮得率按式（1）計算：

1.3.2 標準曲線繪制與總黃酮含量測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法進行標準曲線繪制與樣品中總黃酮的檢測[15]。蘆?。≧T）標液在0.036~0.360 g/L濃度區間內與吸收值具有良好的線性關系，擬合方程為：y=1.280 6 x+0.083 6（R2＝0.997 7），依據樣品液吸收值和擬合方程計算樣品液及干樣品中的總黃酮。

1.3.3 單因素設計在功率400 W、乙醇體積分數60%、液固比30:1（mL/g）、提取溫度（30±2）℃和超聲時間20 min等固定條件下，每個因素設6個水平，其中在功率100~600 W、乙醇體積分數0~100%、液固比10:1~60:1（mL/g）、溫度30~80℃和超聲時間10~60min條件下，考察總黃酮得率對各單因素變化的響應。

1.3.4 響應面設計為得到金花小檗果實總黃酮最佳提取參數，采用Box-Behnken法（Design-Expert 8.0.6版）進行響應面實驗優化設計。在單因素試驗結果分析基礎上，選取對總黃酮得率影響較大的超聲功率、乙醇體積分數和液固比等3個因素，以總黃酮得率為響應值，對實驗結果進行回歸和優化，并對最佳提取參數進行驗證。響應面設計見表1。

1.3.5 抗氧化能力評價依據張鶴等[18]的檢測方法，評價樣品的DPPH自由基清除率，再根據清除率得出樣品的IC50值（半數抑制濃度）。依據文獻[18]的檢測方法，評價樣品的Fe3+還原能力，以Trolox當量表示樣品FRAP值。依據Xu等[19]檢測方法，評價樣品的總自由基清除能力（TRAP），以Trolox當量表示樣品TRAP值。

1.3.6 數據處理每組試驗重復3次，實驗結果以均值±標準差表示，用Microsoft Excel 2010、Design-Expert 8.06和Origin 9.0軟件進行試驗數據分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對提取得率的影響由圖1（a）可見，超聲功率100~500 W時總黃酮得率呈現上升趨勢，超聲功率500~600 W時總黃酮得率略有下降。原因可能是一定條件下超聲波的空化效應會加速黃酮類成分的釋放，總黃酮得率在500 W時最大，繼續增加功率，可能造成黃酮成分破壞，使總黃酮得率略有下降。

2.1.2 乙醇體積分數對提取得率的影響如圖1（b）所示，乙醇體積分數在0~60%時總黃酮得率與乙醇體積分數變化趨勢相同，乙醇體積分數60%時總黃酮得率達到峰值，繼續提高乙醇體積分數，總黃酮得率逐漸迅速降低，乙醇體積分數為100%時總黃酮得率僅為13.17 mg RT/g。原因可能是金花小檗種子的主要黃酮類成分極性接近60%乙醇，乙醇進一步提高，過多醇溶性和脂溶性雜質溶出，使得總黃酮得率下降[20]。

2.1.3 液固比對提取得率的影響由圖1（c）可見，液固比為10:1~30:1時總黃酮得率隨液固比增大而迅速提高，在液固比為30:1時總黃酮得率達到峰值，液固比進一步增大時總黃酮得率變化較小。原因可能是液固比適量增大使料液接觸更充分，促進黃酮類化合物溶出；當溶劑滿足溶質溶解需要后，繼續增加溶劑量可能導致其他雜質也被大量提取出來，且溶劑過多易導致后續濃縮等工藝中的總黃酮損失，導致目標成分得率下降[21,22]。

2.1.4 提取溫度對提取得率的影響如圖1（d）所示，總黃酮得率在提取溫度為30~60℃時快速增加，60~70℃時增速變緩并在70℃時達到峰值，進一步升高溫度時總黃酮得率略有下降。原因可能是黃酮類成分在乙醇溶液中的溶解度隨溫度升高而增大，但溫度過高又會破壞黃酮類化合物結構穩定[23]，從而導致黃酮提取率下降。

2.1.5 超聲時間對提取得率的影響由圖1（e）可見，超聲處理時間在10~40 min時，總黃酮得率隨超聲時間延長而迅速提高，超聲40 min后總黃酮得率隨時間延長呈小幅下降趨勢。原因可能是超聲時間過長會導致溶劑揮發增多，以及黃酮類成分氧化或分解[22]，從而使總黃酮得率在提取溶液體系達到傳質平衡后開始逐漸下降。

圖1 提取條件對總黃酮得率的影響Fig.1 The effects of different conditions on the yields of the total flavonoid

2.2 總黃酮提取參數的RSM優化

2.2.1 RSM實驗設計與結果由單因素實驗結果，選取超聲功率（x1）、乙醇體積分數（x2）和液固比（x3）為響應變量，以金花小檗種子總黃酮得率為響應值（y），應用Box-Behnken法，進行3因素3水平的提取參數響應面優化，見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計與結果Table 1 The Box-Behnken design and results

對表1的實驗結果進行回歸分析（表2），得到以金花小檗種子總黃酮得率y為因變量，以x1、x2、x3為自變量的回歸模型方程式（2）：

表2 方差分析Table 2 The analysis of variance

由表2的方差分析結果可知模型的F值=65.98（P＜0.000 1），達到極顯著水平，具有統計學意義；失擬項的P=0.190 5，不顯著，即模型的擬合度好；復相關系數（R2）為0.988 3，校正決定系數R2Adj為0.973 4，說明預測值與實測值高度相關，可解釋97.34%的總黃酮得率響應值變化。因此，所建模型的準確性和可信度較高，可用于提取分析和預測總黃酮提取得率。

2.2.2 RSM結果分析由圖2 a可見，液固比為30:1時，等高線圖接近圓形，說明超聲功率（x1）和乙醇體積分數（x2）的交互作用對得率的影響均不顯著[24]。由圖2 b可見，乙醇體積分數為60%時，總黃酮得率隨功率提高而增加，在液固比加大情況下，總黃酮得率先降后升，且等高線為橢圓形，表明功率和乙醇體積分數之間具有交互作用。從圖2 c可知，超聲功率為500 W時，隨著乙醇體積分數和液固比提高，總黃酮得率均呈先增后降趨勢，等高線為近圓形，說明乙醇體積分數和液固比的交互作用對總黃酮得率影響不顯著。

圖2 不同提取變量相互作用對總黃酮得率影響的響應面圖Fig.2 Response surface plots for interactions between three extraction parameters on extraction yields of the total flavonoids

2.2.3 最佳工藝條件與驗證將實驗結果帶入軟件，分析得到最佳工藝條件：功率503W，乙醇體積分數59%，液固比31:1，預測總黃酮得率最大值21.27 mg RT/g。考慮到實驗操作的便捷性，對預測得到的最佳工藝進行小幅調整：功率500 W，乙醇體積分數59%，液固比30:1，提取溫度70℃，超聲時間40 min，在此條件下平行進行3次實驗，測得TF的得率為（21.36±0.26）mgRT/g，與預測值誤差小于1%，說明實驗結果與模型關聯度較好，模型的預測結果可信度高。

2.3 抗氧化活性

最佳工藝下得到的提取物分別檢測其DPPH自由基清除率、FRAP值和TRAP值（圖3）。由圖3 a可見，金花小檗提取物對DPPH自由基的清除率隨其質量濃度的增大而逐漸提高，提取物質量濃度為111mg/L時的自由基清除率可達54.65%，提取物對DPPH的IC50值為89.46 mg/L，Vc對DPPH的IC50值為3.45 mg/L。由圖3 b可見，金花小檗提取物質量濃度與FRAP值和TRAP值之間也呈現出明顯的正相關關系；提取物質量濃度為111mg/L時，FRAP值為19.69molTrolox/L，TRAP值為30.93 mol Trolox/L。

圖3 金花小檗種子提取物的抗氧化活性評價Fig.3 The antioxidant properties of the B.wilsonae seed extracts

3 討論

目前，國內外對金花小檗種子總黃酮的研究相對較少，對其優化提取以及抗氧化方面的研究亦尚屬空白。該試驗采用超聲輔助乙醇提取金花小檗種子總黃酮，通過單因素試驗和響應面設計獲得優化提取參數，得到最佳提取參數為超聲功率500 W、乙醇體積分數59%、液固比30:1（mL：g）、提取溫度70℃、超聲時間40 min，該條件下金花小檗種子總黃酮提取得率為21.36 mg RT/g；進一步利用3種不同體外實驗方法檢測提取物的抗氧化活性，金花小檗種子質量濃度為111 mg/L時DPPH自由基的清除率可達54.65%，FRAP值和TRAP值以每克樣品的Trolox當量表示，分別為19.69 mol Trolox/L和30.93 mol Trolox/L，為綜合開發利用我國小檗屬植物資源提供了理論依據。