葛根護肝片對慢性酒精性肝損傷大鼠保護作用研究

趙宏宇，王玉，劉新宇，宋蓮蓮，史頂聰，史保銀，邸琳

（吉林省中醫藥科學院，吉林 長春130012）

根據世界衛生組織（WHO）報道，全球飲酒人群數量高達20億，其中濫用酒精超過750萬人，據統計，臨床中有4%~25%的疾病與飲酒有關[1]。肝臟是人體內酒精代謝的最主要器官，90%~95%的酒精均在肝組織中代謝，少量酒精在腎臟和肌肉等其他組織器官中進行代謝[2]。過量攝入酒精會引起酒精性肝損傷（alcohol-induced liver injury,AILI），導致肝組織出現病變，如果不加干預任其長期發展，可能會引發脂肪肝、肝炎、肝硬化甚至肝癌[3]。AILI的機制尚不完全清楚，根據現有研究，乙醇及乙醛的代謝、脂代謝異常、氧化應激損傷、炎癥反應以及肝細胞凋亡等在AILI發生和發展過程中都起到關鍵作用[4]。大量研究表明，很多中藥材和食源性天然產物的功能成分可通過調節酒精代謝、抗氧化應激、抗炎癥反應、改善脂代謝、抗細胞凋亡和改善腸道菌群等多種途徑干預和治療AILI[5,6]。葛根護肝片是吉林省中醫藥科學院研發的一款保健食品，由葛根、枳椇子、白芍及甘草等配伍而成，前期實驗表明葛根護肝片對急性和亞急性酒精性肝損傷小鼠有明顯的保護作用[7]。本研究選用酒精攝入量遞增法的慢性酒精性肝損傷大鼠模型作為實驗對象，從不同角度研究并驗證葛根護肝片對慢性酒精性肝損傷的治療及干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物SPF級SD雄性大鼠[實驗動物生產許可證號：SCXK-（遼）2015-0001，75只，體質量150~170g，實驗動物質量合格證號：211002300052368]遼寧長生生物技術股份有限公司[試驗動物使用許可證號：SYXK（吉）2015-0009，由吉林省中醫藥科學院實驗動物倫理委員會審核通過，符合實驗動物倫理委員會規定]；大小鼠顆粒飼料購自北京科奧協力飼料有限公司[飼料生產許可證號：SCXK-（京）2019-0003]。

1.1.2 藥物及試劑葛根護肝片由吉林省中醫藥科學院自制，每1 g含各藥材提取物相當于生藥材葛根1.28 g、枳椇子1.28 g、白芍0.64 g、甘草0.64 g；無水乙醇（批號：20160602，北京化工廠）；葛根枳椇軟膠囊（批號：818021101，威海紫光生物科技開發有限公司）；MDA試劑盒（批號：20191122）、SOD試劑盒（批號：20191120）、總蛋白定量試劑盒（批號：20191120）均購于南京建成生物工程研究所；TG試劑盒（批號：201907152）、TC試劑盒（批號：20190830）、LDL-C試劑盒（批號：2019081202）、TBIL試劑盒（批號：20190926）、ALT試劑盒（批號：20190904）、AST試劑盒（批號：20180725）均購于迪瑞醫療科技股份有限公司；-GST ELISA試劑盒、Arg-1 ELISA試劑盒、PNP ELISA試劑盒、GLDH ELISA試劑盒（批號均為:NOV2019）均購于上海語純生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

CS-600B型全自動生化分析儀（長春迪瑞實業有限公司）；DNM-9602型酶標儀（北京普朗新技術有限公司）；723可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；HC-3618R高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；SSW-600-2S型電熱恒溫水槽（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；JA2003B型千分之一電子天平（上海越平科學儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及造模雄性SD大鼠，適應飼養1周后，隨機分為6組，分別為正常對照組、模型組和陽性藥組，葛根護肝片高、中、低劑量組。每日上午，正常對照組和模型組大鼠灌胃0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，陽性藥組大鼠按333.3 mg/kg灌胃葛根枳椇軟膠囊內容物的0.5% CMC-Na溶液，葛根護肝片高、中、低劑量組大鼠分別按520.8mg/kg、260.4mg/kg、130.2 mg/kg灌胃葛根護肝片的0.5%CMC-Na溶液，所有大鼠灌胃體積均為10 mL/kg，連續灌胃28 d。除正常對照組大鼠外，其他各組大鼠每日下午灌胃乙醇溶液制備大鼠慢性酒精性肝損傷模型，乙醇灌胃濃度采用分階段遞增方式，第1階段（第1日至第3日）灌胃30%的乙醇溶液，第2階段（第4日至第6日）灌胃40%的乙醇溶液，第3階段（第7日至第21日）灌胃50%的乙醇溶液，第4階段（第22日至第27日）上午給藥后灌胃30%的乙醇溶液，下午灌胃50%的乙醇溶液。各階段每次乙醇溶液灌胃體積均為10mL/kg，正常對照組大鼠每日下午灌胃與乙醇溶液等量的蒸餾水。

1.3.2 動物處理及指標檢測末次灌胃給藥后1 h，大鼠腹腔注射2%的戊巴比妥鈉3 mL/kg麻醉，腹主動脈取血，離心取血清保存備用。分離肝臟，摘取肝左葉稱重，以肝葉重量10倍體積的生理鹽水研磨肝葉，研磨液4℃放置過夜，離心取上清液保存備用；摘取肝右葉，用4%的甲醛固定，制備石蠟切片，HE染色，進行病理組織學檢查。

以全自動生化分析儀檢測血清中TC、TG、LDL-C和TBIL的含量及GOT、GPT的活力。ELISA法檢測血清中-GST、Arg-1、PNP和GLDH的活力。測定10%肝臟研磨液中總蛋白、MDA的含量和SOD的活力。

1.4 數據處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析處理，各數值用x±S表示。多組間比較采用One-way ANOVA檢驗，兩兩比較方差齊采用LSD法，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 大鼠一般情況

大鼠在構建慢性酒精性肝損傷模型過程中，表現皮毛枯黃，體重減輕，平時趴臥聚堆，精神萎靡，但進行灌胃等操作時較為暴躁，特別是灌胃乙醇溶液時，反抗強烈。大鼠每日下午灌胃乙醇溶液后15 min出現昏睡，在第3階段乙醇濃度提高后，部分大鼠灌胃后可達到翻正反射消失的狀態。在乙醇溶液灌胃第3階段，大鼠出現死亡情況，模型組共死亡2只，陽性藥組、高劑量組和低劑量組各死亡1只。死亡大鼠死亡前體重減輕嚴重，經解剖檢查發現肝臟充血發黑，疑似肝衰竭導致死亡。

2.2 對慢性酒精性肝損傷大鼠肝功指標的影響

與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠血清中ALT的活力和TBIL的含量顯著升高（P＜0.01），AST的活力略有升高，無顯著性差異（P＞0.05）。與模型組大鼠相比，陽性藥組和葛根護肝片高劑量組大鼠ALT的活力明顯下降（P＜0.05），葛根護肝片低劑量組大鼠TBIL的含量明顯下降（P＜0.05），其他指標未見明顯差異。具體結果見表1。

表1 對慢性酒精性肝損傷大鼠肝功指標的影響Table 1 Effect on index of liver function in Chronic Alcoholic Liver Injury rats

2.3 對慢性酒精性肝損傷大鼠血脂指標的影響

與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠血清中TC、TG的含量顯著升高（P＜0.01），LDL-C的含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組大鼠相比，陽性藥組大鼠血清中TG的含量明顯下降（P＜0.05）。葛根護肝片高劑量組大鼠血清中TC的含量顯著下降（P＜0.01），TG的含量和LDL-C的含量明顯下降（P＜0.05）。葛根護肝片中劑量組大鼠血清中TC的含量和TG的含量明顯下降（P＜0.05）。具體結果見表2。

表2 對慢性酒精性肝損傷大鼠血脂指標的影響Table 2 Effect on index of blood lipid in Chronic Alcoholic Liver Injury rats

2.4 對慢性酒精性肝損傷大鼠肝臟中的MDA和SOD的影響

與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠肝臟中MDA的含量明顯升高（P＜0.05），SOD的活力明顯降低（P＜0.05）。與模型組大鼠相比，葛根護肝片高劑量組和中劑量組大鼠肝臟中MDA的含量明顯降低（P＜0.05）。肝臟SOD的活力方面，各給藥組大鼠均 無顯著影響（P＞0.05）。具體結果見表3。

表3 對慢性酒精性肝損傷大鼠肝臟中MDA和SOD的影響Table 3 Effect on MDA and SOD in liver of Chronic Alcoholic Liver Injury rats

2.5 對慢性酒精性肝損傷大鼠早期肝損傷指標的影響

與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠血清中PNP、-GST、GLDH和Arg-1的活力均顯著升高（P＜0.01）。與模型組大鼠相比，陽性藥組大鼠血清中GLDH的活力明顯下降（P＜0.05）。葛根護肝片高劑量組大鼠血清中PNP、-GST、GLDH和Arg-1的活力均明顯下降（P＜0.05），葛根護肝片中劑量組大鼠血清中GLDH的活力明顯下降（P＜0.05）。具體結果見表4。

表4 對慢性酒精性肝損傷大鼠早期肝損傷指標的影響Table 4 Effect on index of early liver injury in Chronic Alcoholic Liver Injury rats

2.6 對慢性酒精性肝損傷大鼠肝組織病理的影響

正常對照組大鼠（圖1 a）的肝內可見多個肝小葉，肝索及肝竇排列整齊，匯管區3種管道結構清楚可見，無明顯異常，呈正常肝組織結構。模型組部分大鼠（圖1b）肝細胞發生氣球樣變性為主，部分大鼠可見肝細胞脂肪變性，2只動物可見肝細胞輕微點狀壞死；比較正常對照組，模型組肝細胞損傷模型成立。陽性藥組大鼠（圖1 c）肝細胞可見脂肪變性，肝細胞疏松變性，肝細胞未見點狀壞死，未見炎細胞浸潤；比較模型組，陽性藥組肝損傷程度減輕，有效緩解肝細胞損傷變性。葛根護肝片高劑量組大鼠（圖1 d）肝細胞脂肪變性的程度減輕，肝細胞以疏松變性為主，未見肝細胞壞死，未見炎細胞浸潤；比較模型組，葛根護肝片高劑量組可以有效減輕肝損傷的程度。葛根護肝片中劑量組大鼠（圖1e）肝細胞氣球樣變的程度得到有效減輕，肝細胞以疏松變性為主，少見肝細胞壞死，未見炎細胞浸潤；比較模型組，葛根護肝片中劑量組可以有效減輕肝損傷的程度。葛根護肝片低劑量組大鼠（圖1 f）肝細胞損傷程度得到有效的減輕，可見肝細胞以疏松變性，少見肝細胞脂肪變性，未見炎細胞浸潤；比較模型組，葛根護肝片低劑量組可以有效減輕肝損傷的程度。

圖1 各組大鼠肝組織形態的比較（HE 400）Fig.1 Comparison of liver histology in rats from each group(HE400)

3 討論

大鼠在酒精耐受能力方面差異很大，這方面可能與東亞人對酒精的耐受差異情況相似（部分東亞人乙醛脫氫酶2型突變導致不耐受酒精），部分大鼠長期服用濃度為50%的酒精后無明顯不良反應，體重外觀和正常對照組大鼠幾乎無異，而一些大鼠會出現肝衰竭死亡，因此，在制備慢性酒精性肝損傷大鼠模型時，保證盡可能高的酒精攝入量，同時確保較高的大鼠存活率至關重要。本研究選用的模型制備方法是酒精攝入量遞增法，該法主要借鑒酒精性肝損傷動物模型制備規范（草案）[8]，并根據實驗室經驗做出了一些調整。與制備慢性酒精性肝損傷大鼠模型常用的酒精攝入量恒量法相比，酒精攝入量遞增法在大鼠耐受性和體重外觀方面都有一定的優勢，死亡率也較低，而且可以長期維持50%濃度10 mL/kg的酒精灌胃量，甚至在最后1周能耐受上、下午兩次灌胃酒精溶液，對慢性酒精性肝損傷模型的成功制備提供了保證。

本研究中大鼠長期灌胃乙醇后，血清中的ALT明顯升高，AST無明顯變化。ALT主要存在于肝細胞胞漿中，AST多數存在于肝細胞線粒體中。因此ALT作為肝損傷指標相比AST更為敏感，在肝細胞膜損傷階段即可發現，但同時也說明長期飲酒并不能對大鼠肝臟造成嚴重損傷。在之前的研究中[7]，小鼠長期用30%的乙醇灌胃后血清中ALT、AST的活力皆無明顯變化，但肝臟中的GSH明顯升高了，這與普遍認為的飲酒后肝臟中GSH的耗竭理論正好相反，推測大、小鼠肝臟對長期飲酒造成的肝損傷有較強的代償能力，提高肝臟中GSH等抗氧化酶的儲備量可能就是其代償方式之一。雖然肝臟能部分代償酒精帶來的肝損傷，但攝入酒精給予肝臟的代謝壓力仍然存在，肝臟代謝酒精會抑制肝臟中的三羧酸循環和脂肪酸代謝，因此肝臟對血液中甘油三酯和膽固醇等轉運能力下降，以致血脂升高，肝細胞發生脂肪變性[9]。因此酒精造成的肝臟綜合性影響仍然不能忽視，為更好評價和研究葛根護肝片對慢性酒精性肝損傷的保護作用，本研究選擇了早期肝損傷生物標志物-GST、Arg-1、PNP和GLDH，這些指標在肝損傷階段比ALT、AST等傳統指標更早出現變化，且變化幅度大，作為肝損傷指標敏銳度要高于ALT和AST[10-12]，其中-GST存在于肝小葉中心細胞，屬于肝臟代謝區，更具代表意義；其分子量小，在肝細胞膜早期損傷階段就會透過細胞膜進入血液；-GST在紅細胞中不表達，肌肉細胞中也幾乎沒有，因此不受溶血、運動疲勞等因素影響[13]，是非常理想的早期酒精性肝損傷指標。

葛根護肝片可以降低慢性酒精肝損傷大鼠血清中ALT、PNP、-GST、GLDH和Arg-1的活力，可降低血清中TC、TG和LDL-C的含量，減少肝臟中MDA的含量，減少肝臟脂肪變性程度，說明其不僅可直接降低慢性酒精性肝損傷程度，還可以緩解肝臟的脂代謝壓力，從多方面改善大鼠慢性酒精性肝損傷，具體影響機制有待繼續研究。