高良姜含藥血清及主要成分對TRPA1信號通路的影響

李夢秋，黃 娟，鄒國發，李坤平，馮毅凡，明 露，高振虎，陳艷芬

(廣東藥科大學 1.中藥學院、2.中醫藥研究院、3.新藥開發中心，廣東 廣州 510006)

高良姜是姜科植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根莖，產于中國東南部(廣東、廣西、海南)，性熱、味辛，溫胃止嘔、散寒止痛，臨床常用于治療脘腹冷痛、噯氣吞酸、胃寒嘔吐等消化系統疾病。研究表明，高良姜具有明顯的鎮痛作用，除了胃痛腹痛，對原發性痛經等疼痛也具有顯著療效[1-2]。盡管在體內研究中已經證實了高良姜的鎮痛作用，但其潛在的鎮痛作用的分子機制仍不清楚。瞬時受體電位通道蛋白1(TRPA1)是瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)超家族的一員，是一種對鈣離子具有高通透性的非選擇性陽離子通道，通常在小直徑的初級傳入神經纖維中表達，與感知外界傷害性刺激相關，可被各種外源性刺激物激活，如有害的低溫、芥子油中的異硫氰酸烯丙酯、過氧化氫和不飽和醛等內源性反應物質[3]。研究表明[4]，TRPA1通過感覺神經激活參與痛覺和炎性疼痛的感知，TRPA1通道的激活可增加細胞內Ca2+濃度，最終導致傷害性或傷害性反應。因此，以TRPA1為目標蛋白成為開發新型鎮痛藥的研究熱點。在前期研究中，我們采用脂質體轉染法構建了穩定表達TRPA1通道的HEK-293T細胞系[5]。本研究采用TRPA1-HEK293T細胞模型，體外研究高良姜是否對TRPA1表達具有調節作用，以期闡述中藥高良姜溫中止痛的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1細胞株 人胚腎(HEK-293T)細胞，采用脂質體轉染法將TRPA1真核表達質粒轉入HEK-293T細胞中，構建穩定表達TRPA1通道的TRPA1-HEK293T細胞株。由本實驗室傳代培養保存。

1.1.2實驗動物 SPF級SD大鼠，♀♂各半，體質量(200 ± 20)g，合格證號SCXK(粵)：2013-0034，購自廣東省醫學實驗動物中心，飼養于廣東藥科大學動物房，飼養條件為恒溫(24 ± 2)℃，相對濕度50%-70%。

1.1.3藥物與試劑 高良姜飲片(康美藥業股份有限公司，批號：160202851)；高良姜黃酮部位、二苯基庚烷部位、揮發油部位由本實驗室自制[6]；DMEM培養基(美國Hyclon公司)；總RNA提取試劑TRIzol(Invitrogen公司)；GoScriptTMReverse Transcription試劑盒(Invitrogen公司)；兔多克隆抗體TRPA1(Abcam公司)；二抗(羊抗兔)HRP標記(JACKSOM)；兔多克隆抗體β-actin(萬類生物科技有限公司)；cAMP ELISA試劑盒(美國R&D公司)；EnlightTMWestern 特異發光檢測試劑盒(北京英格恩生物科技有限公司)；色譜甲醇(瑞典歐普森公司)；色譜乙腈(瑞典歐普森公司)；高良姜素(成都曼思特生物科技有限公司)；高良姜二芳基庚烷A參照化合物由廣東藥科大學新藥開發中心自制，化學結構式為1-苯基-7-(3′-甲氧基-4′-羥基)苯基-5-醇-3-庚酮，按HPLC面積歸一化法計，質量分數不低于98.0%[7]。

1.1.4主要儀器 T100TM PCR儀(伯樂生命醫學產品新加坡有限公司)；TOCAN領成全自動凝膠成像系統(上海領成生物技術有限公司)；ELX800全自動酶標儀(Biotek Instruments公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 TRPA1-HEK293T細胞經復蘇后，使用10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的高糖DMEM培養基，在含有95%濕度和5% CO2細胞培養箱中以37 ℃恒溫培養，取處于對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2含藥血清的制備 稱取高良姜500 g，加水淹沒中藥浸泡30 min；煎煮至水沸改用溫火，30 min后傾出藥液，雙層紗布濾過，重復共煎煮兩次，合并兩次濾液。水浴90 ℃，濃縮至500 mL，得生藥含量為1 mg·L-1高良姜水煎液。SD大鼠隨機分為高良姜給藥組和空白對照組，禁食12 h，給藥組以10 mL·kg-1灌胃體積給藥，空白組給予同等劑量的蒸餾水，每日1次，連續7 d。末次給藥1 h后，乙醚麻醉，眼眶采血，4 ℃離心，得空白血清和高良姜含藥血清，56 ℃水浴30 min滅活，微孔濾膜過濾，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3MTT法檢測高良姜含藥血清對TRPA1-HEK293T細胞增殖的影響 待細胞長至對數生長期時，0.25%胰酶-EDTA常規消化，1 000 r·min-1離心5 min，收集細胞，細胞計數，完全培養基調整細胞密度為7.5×108個·L-1，96孔培養板內每孔加入180 μL細胞懸液。于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養12 h-18 h，待細胞貼壁后，將平板中培養液吸去，每孔加入空白血清或各濃度(20%、15%、10%、5%、2.5%)含藥血清，每個濃度設置4個平行孔，繼續培養36 h。每孔加入20 μL 5 g·L-1MTT液，繼續培養4 h后，終止培養，將孔內的液體小心吸走，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，至結晶全部溶解，酶標儀于波長490 nm測定每孔的OD值，計算各給藥濃度下細胞的相對活性。計算公式：細胞的相對活性/%=(各濃度實驗組平均OD值/各濃度對照組平均OD值)×100%。

1.2.4RT-PCR法檢測TRPA1 mRNA的表達 6孔培養板內培養細胞，分組給予不同處理，繼續培養36 h后收集細胞。使用TRIzol試劑提取細胞總RNA后，按逆轉錄PCR(RT-PCR)試劑盒說明書擴增目的基因，PCR擴增條件為：94 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，共循環35次。以β-actin為內參，引物如下：TRPA1，F:5′-AACCGCTAGAGCTCCTCAA-3′，R:5′-GAGGAATAAGGGCAACACGA-3′，399 bp；β-actin，F:5′-GACCCAGATCATGTTTGGACAC-3′，R:5′-GCAGTAATCTCCTTCTGCATCC-3′，600 bp。將DNA樣品8 μL與樣品緩沖液2 μL混合，加入凝膠點樣孔，120 V下1 %瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像分析系統拍照分析，測定電泳條帶光密度值，計算TRPA1和β-actin光密度比值相對值作為半定量指標。

1.2.5Western blot 法檢測TRPA1蛋白的表達 6孔培養板內培養細胞，分組給予不同處理，繼續培養36 h后收集細胞。提取各組細胞總蛋白，用BCA蛋白檢測試劑盒定量，進行SDS-PAGE電泳，電轉到NC膜上，剪取目的蛋白條帶，并在室溫下用含有5%脫脂乳的封閉緩沖液封閉2 h。用抗TRPA1(1:250)和兔抗人β-actin(1 ∶1 000)的一抗在4 ℃孵育過夜，然后用HRP連接的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗在室溫下孵育1 h。用化學發光Ecl法檢測目的蛋白，并用Image J進行圖像分析。

1.2.6ELISA 法檢測細胞cAMP濃度 分別為用5%、10%、15% 3個濃度的高良姜含藥血清和空白血清組，每孔設3個復孔，繼續培養36 h。棄培養基，常規消化，收集細胞沉淀，重懸，破碎細胞，4 ℃ 600×g離心10 min，吸取上清。根據cAMP ELISA 試劑盒說明，檢測HEK293T-TRPA1細胞cAMP水平，檢測波長為450 nm。

1.2.7激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內Ca2+濃度 實驗分為空白含藥血清組、15%高良姜含藥血清組、10%高良姜含藥血清組和5%高良姜含藥血清組，每組細胞培養于激光共聚焦顯微鏡專用培養皿中，細胞貼壁后，每組分別給藥處理36 h，D-Hanks溶液沖洗3次，終濃度10 μmol·L-1的Fluo-3/AM、0.1% F-127的D-Hanks溶液37 ℃避光負載30 min，D-Hanks溶液沖洗3次，洗去多余的染料。直接取各組細胞皿置激光共聚焦顯微鏡的載物臺上，以488 nm的氬激光激發Fluo-3產生綠色熒光，觀察各皿中細胞的形態、細胞中Ca2+的熒光強度及分布變化。采集圖像，并采用FV10-ASW1.7圖像分析軟件分析計算平均熒光強度。

1.2.8HPLC法分析高良姜含藥血清成分

1.2.8.1 對照品溶液的制備 精密稱量高良姜素對照品和二芳基庚烷A對照品10 mg，分別置于25 mL棕色量瓶中，色譜甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得標準品溶液(含高良姜素0.4 g·L-1，含二芳基庚烷A 0.4 g·L-1)。

1.2.8.2 血清樣品的處理 將空白組和高良姜給藥組的大鼠血清分別混合，混勻后各精密吸取0.5 mL，加入0.75 mL色譜純乙腈，在渦旋混合器上振蕩2 min使充分混合，10 000 r·min-1的速度離心15 min，取上清液置于2 mL EP管中，用氮氣濃縮吹干后加入120 μL色譜甲醇充分溶解，10 000 r·min-1的速度離心5 min，吸取上清液0.45 μm微孔濾膜過濾，待測。

1.2.8.3 色譜條件 色譜柱：Inertsil?ODS-3柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃，流動相：A液為乙腈，B液為0.2%磷酸水溶液。等度洗脫程序:0-20 min，50% 乙腈，體積流量：1 mL·min-1。檢測波長為220 nm，進樣量為10 μL。

2 結果

2.1 高良姜含藥血清對TRPA1-HEK293T細胞增殖的影響MTT結果顯示高良姜各濃度含藥血清(20%，15%，10%，5%，2.5%)的OD值和同濃度的空白血清組比較均無明顯差異，計算細胞相對活性百分率分別為0.987，1.038，1.071，1.161，1.111。顯微鏡下觀察各組細胞狀態良好，細胞貼壁生長，細胞形態成梭形，排列緊密，細胞透明，折光性好，界限清晰(Fig1)。參考實驗室既往研究經驗，后續選擇15%、10%、5% 3種血清濃度作為受試含藥血清濃度。見Fig1。

Fig 1 Effect of A. officinarum medicated serum on growth of TRPA1-HEK293T cells in vitro A:OD n=4);B:Morphological changes (400×).

2.2 高良姜含藥血清對TRPA1 mRNA表達的影響RT-PCR 結果顯示(Fig2A)，與空白血清組比較，15%高良姜組、10%高良姜組、5%高良姜組TRPA1 mRNA表達均下降，其中10%高良姜組、15%高良姜組TRPA1 mRNA表達差異有顯著性(P<0.05)，5%高良姜組差異不明顯。結果提示高良姜能夠在體外下調TRPA1-HEK293T細胞的TRPA1 mRNA的表達。

2.3 高良姜含藥血清對TRPA1蛋白表達的影響如Fig2B所示，與空白血清組比較，15%高良姜組、10%高良姜組、5%高良姜組TRPA1蛋白表達下降，尤其以10%高良姜組TRPA1蛋白表達下降明顯(P<0.05)，5%、15%高良姜組則差異不明顯。

Fig 2 Effect of A. officinarum serum on expression of TRPA1 mRNA and n=3)A:The expression of TRPA1 mRNA;B:The expression of TRPA1 protein.*P<0.05 vs the blank serum group

2.4 高良姜含藥血清對cAMP含量的影響根據標準品測定結果繪制標準曲線圖，曲線方程為Y =1/(0.0824X+3.596)，R2=0.9944，將受試樣品的OD值代入標準曲線方程式計算出各樣品的cAMP濃度(Fig3A)。結果顯示，與空白血清組比較，15%高良姜組、10%高良姜組、5%高良姜組細胞內cAMP含量均有增高，其中15%高良姜組和10 %高良姜組差異有顯著性(P<0.05)，5%高良姜組差異不明顯。結果表明，高良姜能夠提高HEK293T-TRPA1細胞內cAMP濃度。

2.5 高良姜含藥血清對Ca2+濃度的影響Fluo-3/AM進入細胞后，酯基被水解掉，Fluo-3與細胞內Ca2+的結合，在特定激發波長的作用下發出綠色熒光，其熒光強度反映細胞內Ca2+濃度。與空白血清組相比較，15%、10%、5%高良姜組均明顯降低細胞內Ca2+濃度(P<0.01)，提示高良姜可能通過調控TRPA1通道，從而阻斷Ca2+的內流(Fig3B)。

Fig 3 Effect of A. officinarum serum on concentration of cAMP (A)and Ca2+ (B) n=3)**P<0.01 vs blank group

2.6 高良姜有效部位對TRPA1 mRNA表達的影響以2%乙醇作為有效部位的溶劑，故對照組為2%乙醇。分別以2%乙醇、高良姜黃酮部位組(20、10、5 mg·L-1)和二芳基庚烷部位(40、20、10 mg·L-1)給藥處理HEK293T-TRPA1細胞36 h。RT-PCR結果表明，與對照組相比，黃酮類和二芳基庚烷類呈現抑制TRPA1 mRNA表達的趨勢，其中黃酮類20 mg·L-1和二芳基庚烷類40 mg·L-1具有顯著的抑制作用(Fig4)，提示高良姜調節TRPA1信號通路的主要物質基礎可能是黃酮類和二芳基庚烷類成分。

Fig 4 The inhibitory effect of A. officinarum total flavonoids (A),diarylheptane (B)and volatile oil (C)on expression of TRPAl mRNA n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.7 高良姜含藥血清的成分分析精密吸取高良姜素和二芳基庚烷A對照品溶液及空白組和高良姜給藥組血清供試液10 μL，注入液相色譜儀，進行HPLC分析。高良姜素和二芳基庚烷A、高良姜提取液、空白血清、含藥血清、含藥血清加標準品HPLC圖譜見Fig5。高良姜二芳基庚烷A和高良姜素分別在11.053 min和15.052 min出峰。對比Fig5B和Fig5C，空白血清在11.053 min和15.052 min兩處基線較為平穩，無色譜峰出現，高良姜含藥血清則在兩處均有色譜峰出現。此情況下，在高良姜含藥血清中加入適量高良姜素和高良姜二芳基庚烷A標準品溶液進樣得到Fig5E，相較于高良姜含藥血清圖譜，11.053 min和15.052 min兩處色譜峰峰高均有增長，可推斷高良姜素和二芳基庚烷A為高良姜藥材的入血成分。

Fig 5 Representative chromatogram by HPLCA:Diarylheptane A and galangin standard;B:Alpinia officinarum extract;C:Blank serum;D:A. officinarum medicated serum;E:A. officinalis serum add double standard.Retention time of diarylheptane A and galangin was 11.053 min (1)and 15.052 min (2)respectively

3 討論

血清藥理學最初由Tashino于1984年命名[8]，是指給動物口服藥物或藥物的混合物，在一定時間后采集血液分離血清，然后使用含藥血清進行藥物或藥物復方作用的體外實驗研究[9]。該方法更適合中藥的體外研究，首先，避免了原料藥所含雜質對結果的干擾[10]；其次，藥物通過口服途徑進入動物體內，經過吸收和代謝等一系列生物轉化過程，機體血清中所含的藥物成分可能為體內直接作用物質[11]。近年研究表明，在中藥藥理體外實驗中，含藥血清模擬了體內的藥物狀態，通過高效液相色譜法指認含藥血清中的藥源性成分[12-14]，血清藥理學與血清藥化學研究相結合，對于研究中藥藥效物質基礎具有重要意義，為闡明中藥藥理作用機制提供實驗基礎[15]。

TRPA1是瞬時受體電位離子通道家族中的一員，被認為是一種冷刺激的感受器，可被各種外源性刺激物，特別是有害的低溫激活。同時，TRPA1在痛覺產生及痛覺敏感性增強的病理過程中也發揮重要作用，目前是抗炎和鎮痛治療的主要靶點[16]。“寒者熱之，熱者寒之”，中藥高良姜作為一種常用的溫里藥，臨床主要用于脘腹冷痛、噯氣吞酸、嘔吐泄瀉等里寒證的治療，課題組的動物實驗也表明高良姜具有明顯的溫中止痛作用。為了體外研究高良姜對TRPA1信號通路的影響，本實驗室在前期構建了穩定表達TRPA1通道的HEK-293T細胞模型[5]。因此，本研究主要基于冷覺和痛覺感受器TRPA1與中藥寒熱藥性理論的聯系，探究高良姜體外對TRPA1信號通路的影響，揭示高良姜溫中止痛的分子作用機制。

首先，高良姜含藥血清的RT-PCR結果表明，與空白血清組相比，15%高良姜含藥血清組、10%高良姜含藥血清組TRPA1 mRNA表達明顯下降(P<0.05)；蛋白表達結果表明，與空白血清組比較，10%高良姜含藥血清組的TRPA1蛋白表達明顯下降(P<0.05)，提示溫里藥高良姜可能通過下調冷覺感受蛋白TRPA1的表達而發揮溫中散寒作用。其次，我們探討了高良姜對細胞內Ca2+濃度及cAMP濃度的影響。Ca2+作為機體內的第二信使，參與神經遞質釋放、肌肉(包括骨骼肌、平滑肌)收縮、激素分泌、以及細胞的分化、凋亡和死亡等過程。研究顯示，TRPA1通道可以被傷害性冷刺激(<17 ℃)激活，激活后以Ca2+進入的方式將冷覺信息傳入中樞或引起外周肌肉痙攣收縮疼痛。本研究結果顯示，與空白血清組相比較，15%高良姜組、10%高良姜組、5%高良姜組均能明顯降低細胞內Ca2+濃度(P<0.01)，提示高良姜可能通過調控TRPA1通道而阻斷Ca2+內流。環磷酸腺苷(cAMP)是機體內另一個重要的第二信使，參與和調節機體神經遞質傳遞、基因表達、激素調節、免疫反應以及細胞增殖和分化等生理及病理作用[17]。同時，cAMP被認為是與中醫的陰陽(寒熱)密切相關的細胞內第二信使，在虛寒狀態下，cAMP含量降低，虛熱狀態下，cAMP含量升高，常常以cAMP作為闡釋溫里藥溫熱藥性本質的重要指標之一。高良姜含藥血清的ELISA結果表明，與空白血清組比較，15%高良姜組、10%高良姜組、5%高良姜組細胞內cAMP含量均增高，其中15%高良姜組和10%高良姜組差異有顯著性(P<0.05)，提示高良姜的溫中散寒作用也與調控細胞內cAMP濃度有關。

化學研究表明，高良姜的主要化學成分是黃酮類、二芳基庚烷類、揮發油類等[18]。本研究還初步探討了高良姜3類主要成分對TRPA1 mRNA表達的影響，結果發現黃酮類和二芳基庚烷類對高良姜TRPA1 mRNA表達具有抑制趨勢。在本實驗室的前期研究中發現，高良姜黃酮部位和二芳基庚烷部位是高良姜治療脾胃寒證相關疾病的主要有效部位，其中胃腸解痙作用以黃酮類較強，鎮痛作用以二芳基庚烷部位更強[6]。為了進一步確定高良姜調節TRPA1信號通路的物質基礎，采用高效液相色譜法對高良姜的入血成分進行了化學分析。結果表明，高良姜素和二芳基庚烷A是高良姜的主要入血成分。

綜上所述，高良姜作為一種溫里藥，溫中散寒止痛是其最重要的功效之一，體外實驗表明其溫中止痛作用機制可能與調控TRPA1信號通路，從而阻斷Ca2+內流，調節細胞內cAMP濃度等有關，其對TRPA1離子通道的具體調控機制及物質基礎值得進一步探討。