老年失眠患者血清miR-147表達與Treg/Th17水平的關系

秦冰 李莉 劉芳翡 胡亞瓊

(1河南醫學高等專科學校，河南 鄭州 451191；2河南醫學高等專科學校附屬醫院神經內科)

老年失眠是臨床常見的老年睡眠障礙，炎癥反應是其主要危險因素之一，而引起失眠的主要因素有生理因素、疾病因素、精神因素、心理社會因素、環境因素、藥物因素等。老年失眠是導致抑郁的重要因素，最終可能會導致大腦認知功能損傷，對老年人身心健康造成威脅，使其生活質量下降，不良結局發生率升高〔1,2〕。因此早期診斷和治療對于降低老年失眠發生率十分重要。多種微小RNA(miRNA)參與中樞神經系統炎癥反應。研究表明，miR-155能影響腦脊髓炎小鼠輔助性T細胞亞群(Th)1和Th17細胞分化，從而改變炎癥因子表達水平，影響腦脊髓炎病程〔3〕。miR-147作為miR家族中重要一員，更能參與炎癥反應〔4〕。Th在機體免疫反應和炎癥反應中都能發揮重要調節作用〔5〕。其中調節性T細胞亞群(Treg)與Th17有相互拮抗的生理功能，因此炎癥反應發生在機體內時，Treg/Th17比例會發生變化〔6〕。miR-147、Treg/Th17與老年失眠炎癥反應都有一定聯系，但目前關于兩者在老年失眠患者血清中表達水平相關性的研究較少。因此，本研究通過檢測失眠老人血清中miR-147、Treg/Th17水平，探討miR-147與Treg/Th17水平失衡的關系，為老年失眠的預防和評估提供重要依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2019年7月因失眠于河南醫學高等專科學校附屬醫院接受治療的86例老年失眠患者(失眠組)，納入標準：①符合中國睡眠研究會提出的《中國失眠癥診斷和治療指南》中的診斷標準〔7〕；②年齡≥60歲；③近1個月內未服用中藥治療者；④臨床資料齊全者。排除標準：①其他疾病所致的繼發性失眠者；②伴有肝、腎、肺等臟器功能不全者；③有風濕類疾病、其他心肺疾病及精神異常者；④有藥物濫用史患者。本試驗經河南醫學高等專科學校附屬醫院倫理委員會批準，符合倫理學標準，受試對象均由專業人員詳細告知家屬研究內容并自愿參加，并簽署知情同意書。其中男41例，女45例；年齡60～83歲，平均(71.13±6.17)歲，體重指數(24.15±1.24)kg/m2；同期選取84例健康體檢老人作為對照(對照組)，其中男37例，女47例；年齡60～82歲，平均(70.96±7.35)歲，體重指數(24.26±1.35)kg/m2。兩組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。

收集患者入院時一般資料，如性別、年齡、體重指數(BMI)及匹茲堡睡眠質量指數量表(PSQI)評分〔8〕，其中該表有19個自評及5個他評項目，最低分0分，最高分21分，分數高代表睡眠質量差。

1.2主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(批號：DP419)購自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR? Green Mix試劑(批號：Q111-02)購自南京vazyme生物公司；miScript SYBR? Green qPCR試劑盒(批號：330504)購自德國QIAGEN公司；固定破膜劑(Fix&Perm)(批號：GAS-003)、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人干擾素(IFN)-γ單克隆抗體(批號：BSA-0851)、藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人白細胞介素(IL)-4單克隆抗體(批號：LS-C7854)均購自美國Beckman公司。Bio-Rad iQ5型實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購自美國Bio-Rad公司；FACSCalibur型流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3樣品采集及保存 抽取兩組老人清晨空腹靜脈血，3 000 r/min離心15 min后收集血清，離心半徑8 cm，置于-80℃保存，待測。

1.4qRT-PCR法檢測血清中miR-147水平 采用qRT-PCR檢測兩組血清中miR-147水平。RNA提取試劑盒提取血清總RNA，反轉錄得cDNA。采用qRT-PCR儀對miR-147進行擴增。qRT-PCR體系共10 μl：miScript SYBR? Green Mix 5 μl，cDNA(50 ng/μl)1μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反應條件：95℃，5 min；95℃、15 s，58℃、20 s，40個循環；72℃，10 min。miR-147及內參U6的引物序列：miR-147正向引物:5′-AAACATGGAGCAGCCACACATC-3′，反向引物：5′-TCGAGATGTGTGGCTGCTCCATGTTT-3′；U6：正向引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-ΔΔCt法對血清miR-147表達水平進行定量分析。

1.5流式細胞術檢測血清中Treg/Th17水平 RPMI1640〔不含小牛血清(FBS)〕培養基等體積稀釋100 μl血清，加入刺激劑10 μl，37℃、5% CO2培養箱培養4～6 h。混勻，加入CD8-PC7和CD3-PC5各10 μl，室溫下避光孵育15 min；加入100 μl Fix&Perm中的固定液，室溫避光孵育15 min；加入3 ml PBS，1 200 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，棄上清。每管中加入 100 μl Fix&Perm中的破膜和溶血液，各管加入IFN-γ-FITC和IL-4-PE 10 μl，室溫下避光孵育15 min。每管中加入3 ml PBS，1 200 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，棄除上清；0.5 ml PBS重懸細胞，上機檢測。每個樣本每次檢測1×104個細胞。

1.6血清炎性因子水平檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測兩組血清中IL-6、C-反應蛋白(CRP)、轉化生長因子(TGF)-β1、IL-17水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Pearson分析、Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1兩組PSQI評分比較 兩組失眠組PSQI評分顯著高于對照組〔(15.46±3.24)分vs(5.27±1.14)分；t=27.224,P<0.05〕。

2.2兩組血清中miR-147、Th17、Treg及Treg/Th17水平比較 失眠組血清中miR-147、Th17、Treg及Treg/Th17水平均顯著高于對照組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組血清中miR-147、Th17、Treg及Treg/Th17水平比較

2.3兩組血清炎性因子水平比較 失眠組IL-6、CRP、TGF-β1、IL-17水平均顯著高于對照組(P<0.001)。見表2。

表2 兩組血清炎性因子水平比較

2.4失眠老人血清中miR-147與Treg/Th17的相關性 失眠老人血清中miR-147與Treg/Th17水平呈正相關(r=0.536，P<0.05)。見圖1。

圖1 失眠老人血清中miR-147與Treg/Th17水平的相關性

2.5失眠老人血清miR-147、Treg/Th17與血清炎性因子水平相關性 失眠老人血清miR-147、Treg/Th17與IL-6、CRP、TGF-β1、IL-17水平均呈正相關(P<0.05)。見表3。

表3 失眠老人血清miR-147、Treg/Th17與血清炎性因子水平相關性

2.6影響老人失眠的多因素分析 將老人是否發生失眠作為因變量，以miR-147、Treg/Th17、IL-6、CRP、TGF-β1、IL-17、PSQI評分為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示miR-147、Treg/Th17、IL-6是影響老人失眠的危險因素。見表4。

表4 影響老人失眠的多因素分析

3 討 論

失眠指盡管有充足時間入睡，但仍存在持續難以入睡或睡眠質量下降并使日間功能受損的各類行為，其中炎癥反應在其病情發展中有重要作用〔9〕。老年人失眠癥發病率遠高于年輕人，且老年患者長期失眠會出現思維能力下降、妄想、抑郁、緊張等嚴重精神障礙，并導致中樞神經受損〔10～12〕。因此，尋找預測老年失眠傾向標志物，是今后待解決的問題。

許多miR是酪氨酸蛋白激酶/信號轉導與轉錄激活因子(JAK/STAT)抗炎途徑中重要調控因子，而miR-147與此途徑中重要轉錄因子NF-κB有密切聯系〔13〕。miR-147可通過調控某些炎性細胞因子水平，激發炎癥反應，同時導致抗炎反應和促炎反應處于動態失衡，進而影響老年人睡眠狀態〔14〕。林秋偉等〔15〕檢測分析心肌梗死患者血清中miR-147，miR-214等含量，探討其對病變程度及預后情況的判斷價值，最終得出結論：miRNA可能通過調節炎性因子的表達來參與疾病發生和病情發展。本研究提示老年失眠患者血清中miR-147水平高于健康老人，miR-147可能通過在失眠老人血清中高表達來影響某些炎性因子的表達，進一步參與失眠的發生發展。

Th17和Treg是T細胞亞型中重要細胞，參與機體免疫反應，而免疫反應通常與炎癥反應密切聯系〔16，17〕。有研究表明，Treg/Th17細胞平衡比例變化與神經炎癥反應有關，進一步可能會引發失眠病癥。姜立剛等〔18〕通過對帕金森病患者外周血Treg/Th17水平進行檢測分析，探討Treg/Th17平衡與相關細胞因子含量變化的意義，結果證明患者外周血中Treg/Th17水平失衡，且這種失衡與帕金森病神經炎癥反應可能有關。本研究結果提示失眠老人血清中Th17、Treg水平均升高，血清中Treg/Th17處于嚴重失衡狀態，從而引發炎癥反應，進一步加重老人失眠病癥，老年失眠患者體內炎癥水平相較于健康老人升高，miR-147、Treg/Th17相互作用影響老年失眠患者血清炎性因子IL-6、CRP、TGF-β1、IL-17水平，從而影響失眠，miR-147、Treg/Th17、IL-6水平變化影響失眠的發生，且隨三者水平升高，失眠發生概率也升高。

綜上所述，老年失眠患者血清中miR-147與Treg/Th17水平呈正相關，miR-147在血清中的表達水平對Treg/Th17狀態失衡有關。臨床上應密切關注miR-147、Treg/Th17在老年失眠患者血清中的水平，以便及時做出正確的診斷方法并可及時治療。但哪些人群對失眠有易感性，miR-147因子水平是否和失眠易感性人群有關，都有待進一步研究。