毛蕊花糖苷調控Snail1表達在糖尿病腎臟疾病中上皮細胞-間質轉化中的作用

鄭帥 楊敏 白彝華 肖明鮮 張馨心 馬麗 胡紹蘭

(昆明醫科大學第二附屬醫院腎臟內科，云南 昆明 650101)

糖尿病腎臟疾病(DKD)是糖尿病(DM)最重要的并發癥之一〔1〕。目前已成為終末期腎臟病(ESRD)的主要發病原因〔2〕。已有研究發現,1型DM和2型DM發病均與機體免疫狀態異常有關。T細胞浸潤導致的胰島β細胞功能受損可誘導1型DM的形成,而2型DM則與免疫及炎癥反應引起的胰島素抵抗和胰島β細胞分泌功能減退有關，并可能是疾病持續性進展的關鍵〔3〕。有報道,DKD發病前數年患者體內就有炎癥反應增強的跡象〔4〕。盡管機制不清,但多數學者認為,炎癥反應在DKD微血管病變、動脈硬化及與此相關并發癥的發生發展中起到了關鍵作用。目前證實,機體在環境和基因雙重因素的作用下,免疫過度激活和持續的炎癥狀態可引起血糖升高、腎纖維化及血流動力學改變〔5〕。

上皮細胞-間質轉化(EMT)是DKD的主要病理表現，它是腎纖維化的一個重要的過程也是機體免疫過度激活的重要表現。EMT參與腎纖維化的發展主要包括兩個方面：一方面通過改變上皮細胞基因蛋白的表達譜，下調上皮細胞標志蛋白如 E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、角蛋白、閉鎖蛋白的表達，上調間質細胞標志蛋白如波形蛋白(vimentin)、纖維連接蛋白、成纖維細胞特異蛋白(FSP-1)、α-平滑肌肌動蛋白(SMA)的表達。同時，α-SMA 在腎臟的表達水平可以反映腎間質纖維化的嚴重程度；另一方面，間質細胞被激活后分泌的大量基質蛋白等細胞因子參與細胞外基質的合成，促使細胞外基質異常積聚和增多，進一步促進腎纖維化的發展〔6～8〕。研究表明〔9〕，EMT在腎臟疾病中發揮著重要作用，而干預EMT則能有效改善腎臟纖維化。而這一病理過程包含一系列的信號通路和多種細胞因子。Snail通路被認為是介導EMT和其他細胞纖維化的一條重要通路，也是機體免疫過度應激的一種重要表現。一些細胞學研究證明〔10〕，Snail因子會導致上皮細胞丟失黏附因子并出現機體免疫異常，最終導致EMT。因此，Snail1是DKD進展的關鍵。

本研究旨在探討毛蕊花糖苷在延緩腎功能惡化中的免疫機制。高糖誘導腎病模型是經典研究模型之一，被廣泛應用于由于DKD引起機體過度免疫應激而造成的腎纖維化的研究當中。本研究通過STZ誘導大鼠引發DKD模型探討并證實毛蕊花糖苷是否存在延緩腎纖維化及抑制過度免疫應激的作用。

1 材料與方法

1.1DKD大鼠模型的建立 體重150～200 g的SD大鼠35只，隨機分組。在適應環境3 d后隨機分為5組：①C組：對照組(n=7)，②DKD組(n=7)，③A-1組:DKD+毛蕊花糖苷低劑量組(100 mmol/L，n=7)，④A-2組：DKD+毛蕊花糖苷中劑量組(150 mmol/L，n=7)，⑤A-3組：DKD+毛蕊花糖苷高劑量組(200 mmol/L，n=7)。其中除C組外給予STZ，STZ給藥方法參照文獻〔11〕。STZ誘導組大鼠給予高脂飼料飼養4 w后，給予STZ溶液(35 mg/kg)腹腔注射3 d，末次注射72 h后，尾靜脈采血測空腹血糖，2次空腹血糖超過16.7 mmol/L為造DM模型成功，留取正常組與造模組大鼠24 h尿液檢測24 h尿蛋白定量。毛蕊花糖苷粉用生理鹽水溶解，予以大鼠腹腔注射，1次/d，連續5 d，末次注射后20 d后處死大鼠，戊巴比妥麻醉后處死大鼠，取外周血，腎組織進行下一步檢測。

1.2Western印跡 取適量蛋白上清沸水煮變性。每孔上樣30 μg蛋白，marker上樣5 μl，濃縮膠電壓90 V，30 min；分離膠電壓120 V，60 min。測量觀察膠的大小，將濾紙放入轉膜緩沖液中。將聚偏氟乙烯(PVDF)膜做好標記后，然后轉移至轉膜緩沖液中。轉膜60 min。將轉膜結束的膜取出，置于事先配置好的封閉液中〔5%脫脂奶粉(1g脫脂奶粉+20 ml TBST)〕。封閉結束后，用TBST，室溫漂洗3次。將一抗用稀釋劑稀釋，用TBST洗液洗膜3次。將二抗用稀釋劑稀釋。用TBST洗膜3次。顯色，曝光。

1.3免疫組化步驟 切片脫蠟，后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，隨后按選好的免疫組織化學染色方法進行染色。然后PBS洗3 min×3次。每張切片加一抗、二抗。顯色、蘇木素復染和分化，最后脫水、封片。

1.4RT-PCR檢測腎組織中α-SMA，Snail1的表達 應用TrizolRNA提取液提取腎組織中總RNA；采用HiScript?Ⅱ Reverse Transcriptase(Vazyme公司)試劑盒將RNA逆轉錄，依據Vazyme公司熒光定量試劑盒-ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix操作進行PCR擴增，反應體系：2× ChamQ SYBR qPCR混合物：10 μl；PCR上游引物(10 μmol/L，生工)：0.4 μl;PCR下游引物(10 μmol/L，生工)：0.4 μl；50× ROX Reference Dye：0.4 μl；Template DNA：2 μl；無核酸酶水：至20 μl，所用引物序列如下：a-SMA上游：ACTGGGACGACATGGA-AAAG，下游：CATCTCCAGAGTCCAGCACA；Snail1下游：AGCCCA-ACTATAGCGAGCTG，下游：CCAGGAGAGAGT CCCAGATG。

1.5統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1毛蕊花糖苷對大鼠的新陳代謝及生化指標的作用 與C組相比，DKD組血肌酐、24 h尿蛋白明顯增高，A-1組、A-2組、A3組后血肌酐、24 h尿蛋白較DKD組明顯下降(均P<0.05)。與C組相比，DKD組血糖明顯升高(P<0.05)，而與DKD組相比，A-1組、A-2組、A3組血糖差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 大鼠新陳代謝及相關生化指標

2.2毛蕊花糖苷通過下調α-SMA表達對大鼠腎小管的作用 與C組比較，DKD組α-SMA蛋白和RNA水平明顯增高；A-1組、A-2組、A-3組與DKD組比較，α-SMA蛋白和mRNA水平顯著降低,且濃度越高表達水平越低(均P<0.05)。見表2，圖1，圖2。

表2 各組α-SMA mRNA和蛋白表達水平比較

圖1 Western印跡檢測各組大鼠的α-SMA蛋白

2.3毛蕊花糖苷通過抑制Snail1表達對大鼠腎小管的作用 與C組相比，DKD組Snail1蛋白及mRNA水平明顯升高；A-1組、A-2組、A-3組Snail1蛋白及mRNA水平較DKD組明顯降低(P<0.05)。見圖3、表3、圖4。

圖2 各組α-SMA免疫組化(DAB，×100)

圖3 Western印跡檢測各組大鼠的Snail1蛋白

表3 各組Snail1 mRNA和蛋白表達水平比較

圖4 各組Snail1免疫組化(DAB，×100)

3 討 論

由于生活方式和飲食的改變，DM事件的發生率正逐年增長，現在大約有7%的中國成年人是糖尿病患者，數量約為1.14億人，在患DM 10～20年的患者，近1/3的人將發展為DKD〔12，13〕。DKD的發病機制及其進行性腎損害的機制至今尚未完全明了。目前，DKD考慮與血糖代謝紊亂、腎血流動力學異常、高血壓、免疫、遺傳等多種因素有關。DM患者因長期高血糖易造成微血管內皮病變,引發腎實質缺血、缺氧,導致機體氧化應激增強,誘發大量炎癥因子釋放,引發血管炎癥反應。過度免疫應激可導致免疫復合物沉積、腎小球濾過功能降低,導致小管EMT,最終導致腎臟損傷。而腎小球硬化是多種原因導致腎小球損傷和病變的共同結局,也是腎功能衰竭的主要病理基礎。炎癥和免疫功能異常可導致、加重腎臟損傷,導致DKD的發生〔11〕。及時采取有效的措施降低機體炎癥反應,減少尿白蛋白,保護腎臟功能是臨床治療DKD的關鍵。毛蕊花糖苷，又名麥角甾苷、毛蕊花苷，有較好的藥用歷史和基礎。它是一種以β葡萄糖為母核的含有酯酰及氧苷鍵的天然糖苷，是咖啡酸和羥基酪醇與糖苷連接的一部分，且擁有廣泛的藥理活性，如腎功能的保護、免疫調節、抗氧化、抗細胞凋亡等作用〔14〕。因此，本研究評估了在STZ誘導的DKD大鼠中毛蕊花糖苷的治療作用及其中可能的免疫機制。

相關研究表明，腎臟組織中α-SMA是活化的成纖維細胞的常用蛋白標志物，α-SMA陽性的肌成纖維細胞是主要的基質合成細胞〔15〕。在正常腎臟組織中，α-SMA在動脈平滑肌細胞中表達，它是平滑肌細胞的標志蛋白，是間質成纖維細胞轉化為α-SMA的肌成纖維細胞關鍵。它是腎間質成纖維的關鍵，也是導致腎纖維化的重要機制。因此，α-SMA可以作為腎間質纖維化嚴重程度的重要參考指標。而在DKD組中α-SMA明顯增加，說明DKD會導致腎間質中成纖維細胞被大量活化，繼而導致腎纖維化。本研究可以觀察到DKD大鼠腎組織Snail1蛋白激活。相關報道提示〔16〕，細胞外基質增生和腎小管損傷的進展與Snail1通路有關。Snail 超家族具有鋅指結構的轉錄因子，由Snail1(Snail)，Snail2(Slug)和Snail3(Smuc)組成，在誘導EMT、免疫調節、細胞生存等方面具有關鍵作用〔17〕。Snail1及其下游的信號通路對于腎臟EMT發揮了至關重要的作用。Snail1可以誘導間充質、侵襲相關基因表型FN的表達，與此同時它是重要的E-cadherin轉錄調節抑制基因，可以通過下調其他表皮分子，如緊密連接蛋白、閉合蛋白及附膜蛋白，抑制E-caherin的表達，最終參與EMT的調節。Snail1能夠下調中胚層和中外胚層的基因表達，在結合E-cadherin基因的啟動子區，抑制上皮細胞黏附分子表達，誘導上皮細胞彼此遷移，轉變為間充質細胞，進而通過EMT促進中胚層的形成〔18〕。此外，補體系統參與DKD的發生發展，在DKD病理損傷過程中起重要作用，高糖誘導腎組織中C3aR、C5aR增高，導致EMT進而出現腎臟纖維化伴炎細胞浸潤〔19〕。毛蕊花糖苷可以通過降低Snail從而降低DKD的補體中的C3aR及C5aR。Li等〔20〕發現，Snail1過表達抑制了小管上皮細胞的E-cadherin、胎盤鈣黏素(P-cadherin)及足細胞的腎病蛋白(Nephrin)的表達。Boutet等〔21〕通過體內研究發現，成年轉基因小鼠的Snail1活化可以誘導EMT發生和腎的纖維化。Wettstein等〔22〕研究發現，熱休克蛋白(HSP)27可以與Snail結合并導致EMT的發生。Adeshara等〔23〕的實驗表明通過Snail1通路激活導致的細胞改變符合細胞EMT的改變。Snail1在2型DM患者腎組織中高表達，可能參與了DKD發生、發展過程。多種信號通路參與了Snail1介導的EMT〔24〕。Snail1通路是干預DKD腎纖維化的節點也是重要的藥物靶點。本研究結果表明毛蕊花糖苷對DKD引起的腎臟纖維化有較好的療效。