針刺治療對膀胱過度活動癥大鼠膀胱功能及膀胱黏膜組織P2X3蛋白表達的影響

王麗娟 馮琦釩 程亞偉 丁一 陳磊

(海南省中醫院，海南 海口 570203)

膀胱過度活動癥(OAB)是一種膀胱功能障礙綜合征，在2002年國際尿控協會(ICS)正式提出這一概念，其主要以尿急癥狀為特征，伴有或不伴有尿失禁，通常還表現為白天尿頻和夜尿癥〔1〕。有研究〔2〕表明，膀胱黏膜組織配體門控性非選擇性陽離子通道受體(P2X)3蛋白的表達能夠影響膀胱節膀胱逼尿肌等相關功能和OAB疾病的發生。針刺在治療OAB中已有過應用，并且有一定的治療效果。本研究即采用針刺中髎穴、次髎穴治療膀胱過度活動癥大鼠，探究其對大鼠膀胱功能及膀胱黏膜組織P2X3蛋白表達的影響，為今后有關針刺治療OAB研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 30只SD雄性大鼠，2～3月齡，體重220～240 g。采用12 h恒定晝夜交替光照，相對濕度50%～70%，溫度22～26℃的飼養條件，自由飲食飲水，適應性飼養1 w后，將30只大鼠按隨機數字表法分為3組：對照組、模型組、針刺組，每組10只。在整個實驗過程中對動物的處置均遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》中的相關條款。

1.2主要儀器和試劑 Spike8.0數據采集分析系統購自上海騏馳有限公司;Warner差分放大器DP-301 ADInstruments公司；RNA提取試劑Trizol、RNA逆轉錄試劑盒、SYBR@Green RT-PCR試劑盒均購自美國Sigma-Aldrich公司；P2X3單克隆抗體(貨號：PA5-30894)及相應二抗均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3建立膀胱過度活動癥大鼠模型 參照文獻〔3〕的方法，對模型組與針刺組的大鼠采用近端尿道結扎法，建立膀胱流出道梗阻(BOO)誘導的OAB 模型。OAB模型建立的具體方法為：采用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，常規消毒尿道口及四周。用直徑1 mm硬膜外導管從尿道插入膀胱，取下腹部正中切口，切開皮膚及皮下組織，剪開腹直肌前鞘，小心分離腹直肌，找到膀胱，游離膀胱尿道交界處，以3-0絲線結扎近端尿道，結扎松緊度以線結貼緊尿道，探子又可輕易拔出為宜。拔出導管，將膀胱置回原位，使用適量抗生素，縫合切口。對照組大鼠采用除結扎尿道外同樣的手術操作，對每只手術后的實驗大鼠單獨飼養，保持動物籠清潔干燥。

1.4針刺治療 取穴：中髎/次髎穴：位于骶部，S2、S3棘突間隙正中旁開約5 mm。大鼠有3對骶后孔，且影響排尿功能主要以第2骶神經為主，大鼠第2骶后孔相當于人的中髎穴和次髎穴。針刺手法：采用0.20 mm×25 mm毫針，對實驗大鼠采用深刺，垂直刺入S2骶后孔，約15 mm，其中電針參數設置為：強度1 mA，頻率2 Hz，連續波，僅對針刺組大鼠進行持續刺激5 min。電針治療后繼續用0.9% 氯化鈉注射液進行膀胱灌注。

1.5針刺治療對膀胱功能的影響 在大鼠膀胱頂部插入靜脈留置針，通過Spike8.0軟件測量收集實驗大鼠的尿動力學數據。具體參數設置如下，20 kHz采樣頻率，10 kHz Warner差分放大器低通濾波，300 Hz高通濾波。通過三通閥使外導管與壓力感受器和微量灌注泵連接，排空小便后，向膀胱緩慢充滿常溫生理鹽水。將系統壓力在外導管與大氣相通狀態下調零，打開Spike8．0軟件收集記錄針刺干預后膀胱基壓、最大逼尿肌收縮壓、膀胱收縮時間、收縮后膀胱內壓、排尿間隔時間等相關數據。

1.6膀胱黏膜組織P2X3 mRNA的表達 在完成膀胱功能相關指標收集之后，立即處死大鼠，收集膀胱組織，在預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗凈后將其剪成碎片，分成兩份。取其一用Trizol法提取總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，應用SYBR Green實時熒光定量PCR法，對miR-21的表達進行熒光定量分析。熱循環反應條件為：95℃預變性10 min，95℃變性30 s、60℃退火90 s、72℃延伸90 s共40個循環。運用7500 System Software分析結果，得出各組內參基因和目的基因Ct值。

1.7膀胱黏膜組織P2X3蛋白表達 取膀胱黏膜組織碎片，加入適量RIPA裂解液提取總蛋白，并采用二喹啉甲酸(BCA)法對蛋白進行定量。取30 μg待測樣本蛋白進行Westen印跡。具體操作方法如下：在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，把凝膠轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加入5%脫脂奶粉封閉2 h后加入工作濃度1∶1 000的P2X3抗體后在4℃冰箱孵育過夜。再用PBS漂洗3次后，加入相應的二抗孵育2 h后，即可在暗室中X線曝光、顯影，利用Quality One對蛋白條帶灰度進度分析，以β-actin為內參計算樣本蛋白相對表達量。

1.8統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、LSD檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1針刺治療對膀胱功能的影響 與模型組相比較，對照組、針刺組的膀胱基壓和收縮后膀胱內壓均顯著降低(均P<0.05)，最大逼尿肌收縮壓、膀胱收縮時間和排尿間隔時間均顯著升高(均P<0.05)；且與對照組相比較，針刺組的膀胱基壓和收縮后膀胱內壓均顯著升高(均P<0.05)，最大逼尿肌收縮壓、膀胱收縮時間和排尿間隔時間均顯著降低(均P<0.05)。見表1。

表1 各組膀胱功能及P2X3 mRNA和蛋白表達比較

2.2膀胱黏膜組織P2X3 mRNA的相對表達量 3組膀胱黏膜組織P2X3 mRNA的相對表達量差異無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

2.3膀胱黏膜組織P2X3蛋白表達 與模型組相比較，對照組和針刺組的P2X3蛋白相對表達量均顯著降低(均P<0.05)，且與對照組相比較，針刺組的P2X3蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)。見表1、圖1。

2.4膀胱組織P2X3蛋白表達與膀胱功能相關性分析 膀胱基壓和收縮后膀胱內壓與P2X3蛋白相對表達量呈正相關(r=0.676、0.383，均P<0.05)，最大逼尿肌收縮壓、膀胱收縮時間和排尿間隔時間與P2X3蛋白相對表達量呈負相關(r=-0.722、-0.762、-0.794，均P<0.05)。

圖1 各組膀胱黏膜組織P2X3蛋白表達

3 討 論

全球有12%左右的人口受到OAB的影響，其中女性患病率略高于男性，40歲以上人群發病率約為40歲以下人群發病率的十倍〔4，5〕。目前針對OAB有多種治療方案，包括改變生活方式的行為治療、藥物治療、手術治療、神經調節和中醫藥治療。西醫治療多采用抗膽堿能藥物，通過拮抗M受體，減少逼尿肌不自主收縮，改善膀胱感覺功能及抑制逼尿肌不穩定收縮可能，但同時副作用明顯，特異性較差〔6〕。而有研究表明神經調節對藥物治療無效的OAB患者有顯著治療效果〔7〕。

OAB在中醫學并沒有完全對應的概念，但與“淋證”“小便不禁”等相關概念有一定的聯系。針刺治療對膀胱的影響主要表現為調節膀胱的緊張度，解除尿道括約肌痙攣，進而達到治療OAB的目的。根據傳統經絡理論，針刺中髎穴、次髎穴能激發膀胱經氣，促進膀胱氣化〔8〕。研究〔9～12〕表明，針刺中髎穴、次髎穴能夠改善膀胱功能，在OAB臨床治療中具有操作便捷，副作用小等優勢，同時取得了令人滿意的療效。

本實驗結果表明針刺治療能夠有效改善膀胱功能，對于治療OAB有明顯療效，這與莫倩等〔10〕的研究有著類似的結果。P2X3蛋白主要在膀胱黏膜層和黏膜下層表達，作為受體在調控膀胱功能有著重要的作用。研究發現〔13〕，敲出P2X3蛋白基因小鼠的膀胱感受功能受明顯影響，表現為明顯的排尿間隔時間增長和排尿頻次下降，而在P2X3蛋白過表達的小鼠中，過量的P2X3能通過C類傳入神經纖維促進膀胱過度活動。本研究結果顯示正常大鼠和經針刺治療OAB大鼠的膀胱黏膜組織P2X3蛋白表達水平均降低，這一結果此前研究有類似結果〔14，15〕。此外，本研究Pearson分析結果提示膀胱組織P2X3蛋白過表達可能影響膀胱功能，推測OAB模型大鼠膀胱組織P2X3蛋白異常高表達，增加膀胱基壓和收縮后膀胱內壓，降低了最大逼尿肌收縮壓、膀胱收縮時間和排尿間隔時間；同時因為在各組mRNA無明顯差異的情況下，而P2X3蛋白在OAB模型大鼠中出現明顯升高，這說明P2X3蛋白的表達可能受到翻譯水平或是其對mRNA轉錄的負反饋的調節。