黃芪通過上調缺氧誘導因子-1α表達對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護作用

劉明明 殷濤

(赤峰學院附屬醫院普外二科，內蒙古 赤峰 024000)

肝缺血再灌注損傷(HIRI)常并發于肝部分切除術、肝移植等很多的肝外科手術中，它是各種機制相互作用對肝細胞造成損害，進而導致肝功能受損，最終造成肝衰竭，嚴重影響患者預后〔1～3〕。缺氧誘導因子(HIF)-1α是一種在低氧條件下發揮作用的重要轉錄調節因子，在常氧條件下HIF-1α被降解而表達很少，在低氧條件下HIF-1α被激活而大量表達，研究證實，HIF-1α在調整細胞凋亡中起重要作用〔4～6〕。二甲基乙二酰甘氨酸(DMOG)是脯氨酸羥化酶的抑制劑，通常采用此方法來穩定HIF-1α的表達。本研究利用大鼠肝缺血再灌注(HIR)模型，向大鼠體內注入黃芪注射液及DMOG進行預處理，觀察大鼠HIRI后生化指標、免疫組化表達、凋亡情況及肝細胞形態變化，進而探討黃芪對大鼠HIRI的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1動物與分組 雄性SD大鼠96只購于赤峰學院實驗動物中心，體重(220±20)g，隨機分為4組：假手術(Sham)組、缺血再灌注(IR)組、黃芪(AG)組和AG+DMOG組，各組按再灌注1、6、12、24 h分為不同的時間點。

1.2主要試劑 AG注射液生產于成都地奧九泓藥業有限公司(批號：Z51021775)。HIF-1α免疫組化試劑盒是由上海市雅吉生物科技提供。HIF-1α引物是由上海生物工程技術服務有限公司提供；逆轉錄試劑盒購自日本TOYOBO公司。B細胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl-2相關X蛋白(Bax)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1建立動物模型 建立大鼠HIRI模型采用Pingle法。實驗大鼠術前12 h禁食，不限飲水，稱體重。麻醉采用腹腔內注射的方法。IR組：麻醉起效后，常規備皮，消毒鋪巾，切口選取上腹部正中切口，分離出Treitz韌帶，用血管夾阻斷肝門，造成70%HIR模型，40 min后移走血管夾恢復血流，實驗前1 w開始每天自尾靜脈緩慢注射1次3.0 ml生理鹽水；Sham組：游離出肝十二指腸韌帶，不阻斷肝門；AG組：按10 g/kg比例用生理鹽水將AG稀釋到3.0 ml，再灌注前1 w開始每日自尾靜脈注入1次(注藥時間同IR組)。AG+DMOG組：按AG組比例，AG注射液與穩定劑DMOG(40 mg/kg)一起用生理鹽水稀釋到3.0 ml，再灌注前1 w開始自尾靜脈注入1次(注藥時間同IR組)。

1.3.2標本取材 各組在再灌注后各時間點分別對各時間點的大鼠心腔采2 ml血，移至離心管靜止后離心、提血清，再置于-20℃冰箱保存待測；各組大鼠在HIR6h隨機取1只大鼠的1塊左葉肝組織約60 mg，立即放入凍存管保存于液氮中；另取2塊修成1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小，迅速置于甲醛溶液中固定；再修成2塊約0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小，并快速固定于3%戊二醛中。

1.4指標檢測

1.4.1肝生化指標測定 取血清1 ml用生化分析儀測大鼠谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)水平。

1.4.2免疫組化及結果判定 按HIF-1α免疫組化試劑盒操作說明書步驟操作，陰性對照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)。HIF-1α的陽性表達為胞核/胞質內呈棕黃色顆粒。應用計算機系統進行圖像分析，光鏡下每張切片隨機取6個視野，分別計各視野中陽性細胞數，并計算陽性細胞率(即陽性細胞數/視野內細胞總數)。

1.4.3RT-PCR檢測HIF-1α表達 采用Oligo6 和Primer5.0軟件設計PCR引物，HIF-1α上游引物序列：5′-TACTGCAGCAACCAGGTG-3′，下游引物序列：5′-ACAGAAACGAAACCCCAC-3′；β-actin上游引物序列：5′-CTGTCCCTGTATGCCTC-3′，下游引物序列：5′-ATGTCACGCACGATTT-3′。從液氮中取出肝組織塊，參照Trizol試劑盒說明書操作，應用分光光度法測總RNA純度和含量；按Taraka試劑盒說明書進行逆轉錄反應；擴增；利用Eagle Eye型圖像分析系統觀察電泳的結果，測HIF-1α擴增帶的OD值，用β-actin的OD值作為參照，從而得到HIF-1α和β-actin的OD值相對比值。

1.4.4Bax和Bcl-2蛋白測定 將切取的左肝部分組織加9倍量生理鹽水，用勻漿機制成10%肝勻漿，按試劑盒說明書分別采用ELISA測定肝勻漿中Bax和Bcl-2的含量。

1.4.5凋亡檢測 采用TUNEL法行肝組織切片細胞凋亡的原位檢測，具體步驟按試劑盒說明書操作。陽性結果判定：在光鏡下觀察到細胞核/細胞質呈棕黃色顆粒的細胞即為凋亡細胞，各標本的組織切片隨機選取5個400倍視野，從而算出凋亡細胞在平均每100個細胞中的存在比例，即凋亡指數(AI)。

1.4.6電鏡觀察 取出固定于戊二醛的小塊肝組織，按電鏡操作步驟進行，最后觀察、攝片。

1.5統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1各組血清AST、ALT水平比較 各組AST、ALT水平比較：IR組>AG組>AG+DMOG組>Sham組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組灌注后不同時間點血清AST、ALT水平比較

2.2各組HIF-1α mRNA和蛋白表達水平比較 各組肝缺血后再灌注各時間點HIF-1α mRNA及蛋白比較：Sham組

圖1 各組肝細胞再灌注6 h HIF-1α的表達(SP法，×200)

表2 各組再灌注后不同時間肝組織HIF-1α mRNA和蛋白表達水平比較

2.3各組Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較 各組肝組織Bcl-2、Bax蛋白比較：IR組>AG組>AG+DMOG組>Sham組(均P<0.05)。見表3。

表3 各組再灌注后不同時間肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較

2.4各組肝細胞AI水平比較 肝臟凋亡細胞核被染成棕褐色，各組肝細胞AI水平：IR組>AG組>AG+DMOG組>Sham組(均P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 各組肝細胞再灌注6 h凋亡情況(TUNEL，×400)

表4 各組再灌注后不同時間點肝細胞AI比較

2.5各組肝細胞超微結構變化 HIR 6 h后，在電鏡下觀察肝細胞超微結構：Sham組細胞內線粒體及內質網排列規則，細胞核結構清楚；IR組細胞內線粒體明顯腫脹、嵴結構斷裂，且有很大部分空泡變性，有很大一部分細胞核核膜結構消失，還有一部分內質網明顯擴張，其上的核糖體有很明顯的脫落；AG組有部分線粒體及內質網略腫脹，排列尚可，細胞核核膜結構相對清楚；AG+DMOG 組僅有很少的線粒體及內質網略微腫脹，排列也較規則，核膜結構非常清楚。見圖3。

2.6Pearson相關性分析 AG組和AG+DMOG組HIF-1α表達與Bcl-2蛋白表達呈正相關(r=0.784，0.803；均P<0.001)。

圖3 各組肝細胞再灌注6 h超微結構(×15 000)

3 討 論

缺血再灌注對大鼠肝臟造成了很大的打擊，而AG預處理在大鼠HIRI中發揮了重要的保護作用。從實驗數據可看出，HIRI導致大鼠肝酶學指標(ALT、AST)明顯升高，且對大鼠肝臟造成的損傷在HIRI早期(6 h)最為嚴重，本研究結果表明AG對大鼠HIRI有很好的保護作用，另外，因DMOG是HIF-1α的穩定劑，故可推斷AG可能通過調節HIF-1α對HIRI起保護作用。HIRI是一個涉及多階段、多因素的復雜病理生理過程，目前認為它與細胞凋亡密切相關〔7～11〕。Bcl-2是參與HIRI過程中的一個重要的細胞凋亡抑制因子，主要表達產物定位在線粒體、核膜和內質網上，它可通過表達Bcl-2蛋白抑制促凋亡基因的信號傳遞等發揮抗細胞凋亡作用。Bax/Bcl-2是一對凋亡與抗凋亡的基因表達的蛋白，二者表達的平衡結果將決定細胞的凋亡狀態〔12，13〕。誘導細胞凋亡過程的主要分子是Bax二聚體；在Bcl-2存在時，它優先與Bax形成異二聚體，使細胞中游離的Bax形成二聚體從而促進凋亡過程。本研究結果表明細胞凋亡參與了HIRI，AG可以通過抗細胞凋亡對HIRI起保護作用，而AG+DMOG組效果更好，這也說明AG通過抗細胞凋亡來減輕HIRI是通過HIF-1α的參與實現的。

HIF-1是一種能與促紅細胞生成素(EPO)基因結合的核轉錄因子〔14〕。HIF-1由α和β兩個亞基組成的DNA結合性蛋白分子。HIF-1α受氧分壓的調控，在常氧條件下，HIF-1α在脯氨酸羥化酶作用下被蛋白酶體降解，半衰期約5 min；在低氧條件下，HIF-1α的降解受到抑制，以至于HIF-1α表達增加，進而激活下游多種靶基因而發揮生物學作用。目前研究發現，HIF-1α在輕度低氧(1%～3%)情況下發揮抑制凋亡作用，而當重度低氧(0.0%～0.5%)環境中大量表達而誘導細胞凋亡〔15，16〕。本研究結果表明AG是通過上調HIF-1α表達對早期大鼠HIRI起保護作用。