運動+熱量限制對大鼠骨骼肌質量的影響及Akt、mTOR的作用

王今越 王小虹 馮維斗

(1佛山科學技術學院，廣東 佛山 528000；2東北師范大學體育學院；3吉林省體育科研所)

運動是治療慢性病的良藥，在抑制和緩解炎癥、心血管病癥、胰島素抵抗、某些癌癥、免疫失調、神經病變、增齡性認知下降及肌肉流失等均有卓異表現，而熱量限制(CR)有類似作用〔1～4〕。實踐中，二者并非總是單獨應用，聯合實施模式早已廣泛應用于國內外中老年人減肥、2型糖尿病的控制〔1，5〕。而一些重量分級項目(格斗項目與舉重等)和騰躍技巧類項目(體操、蹦床、跳水和花樣滑冰等)的運動員訓練期中也要嚴格執行CR來獲取競賽規則及生物力學方面的優勢〔6〕。盡管應用如此廣泛，理論方面對運動+CR的了解并不深入，這不僅限制了該潛力模式的進一步優化，也忽視了其潛在的危險。

肌肉健康是老年病學和運動學的關注熱點。運動+CR對肌肉的影響和機制報道很少〔7〕，迄今僅有幾個報道〔8～10〕研究很孤立，不能互相佐證，無法很好地解釋聯合模式在調控肌肉健康方面作用。

合成代謝是成體肌肉再生、修復與重塑的基礎。介導合成代謝的絲氨酸蘇氨酸激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)通路是影響肌肉健康的關鍵因素，對肌肉肥大和肌量維持有重要意義。機制上，Akt磷酸化Akt1底物(Akt1s1)，解除其對mTOR的抑制，促其激活下游的核糖體40 s小亞基S6蛋白激酶(p70S6K)最終啟動mRNA 5′端的翻譯。mTORC也會活化并磷酸化重組人翻譯起始因子4E結合蛋白(4E-BP)1，參與形成真核起始因子(eIF)4E復合物，啟動翻譯并編碼細胞周期調節蛋白。規律的運動，特別是抗阻運動會激活該通路，介導肌肉生長發育，而CR對Akt、mTOR的作用存在爭議〔1，11〕。本研究以此為切入點，調查Akt、mTOR在運動和(或)CR干預骨骼肌質量中的作用。

1 材料和方法

1.1動物和分組 清潔級雄性9 w、280～350 g wistar大鼠30只(吉大實驗動物中心，SCXK吉2011-0004)，適應性籠養3 d(全程獨籠飼養)，期間自由進食。稱重后(初始體重)，隨機分組。對照組(C 組):籠養8 w,自由進食與飲水。 運動訓練組(T 組):自由進食與飲水。 訓練方案：前 3 d 為適應性訓練,首日與次日,3% 體重負荷(尾根部纏繞的鉛絲,以橡皮筋固定)、游泳 30 min,每天上午、下午各 1 次,第 3 日改為 6% ,其余同上。 從第 4 日至第 8 周結束為正式訓練,8% 體重負荷、游泳約 60 min、每天 1 次、每周訓練 6 d,周日休息。 游泳過程若出現力竭(水下10 s不能上浮),休息約2 min繼續訓練。熱限組(R組):籠養 8 w,第 1 周前 4 d 按對照組上周平均進食量 80% (即-20%)給食,隨后開始按-40% 給食(每周按上一周對照進食量均數校正),直到 8 w 結束。 運動訓練+熱限組(T+R 組):訓練方案同 T 組,飲食方案同 R 組。T和T+R組分配9只大鼠，各有2只無法完成訓練方案淘汰，C、R組分配6只大鼠。全過程國家標準嚙齒類動物常規飼料喂養、飼養環境為溫度23℃，濕度40%～60%、晝夜12 h光照、黑暗循環。每天下午六點提供食物。方案執行首日為周一，塑鋼游泳池長、寬、高為100 cm×50 cm×60 cm，水深50 cm，水溫保持在(31±2)℃。初始訓練負荷以初始體重校正，其后以每周日重新稱重，校對下1 w負荷。

1.2樣本采集 為避免急性訓練效果，所有樣本在最后1次訓練結束36～48 h后采集。大鼠測量體重后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(0.2 ml/100 g.bw)，麻醉后，以斷頸椎方式處死(處死前12 h禁食)，取右后腿，用4℃預冷的生理鹽水清洗，去除血污，濾紙吸干水分，稱重后切分成數段，錫箔紙包裹，做好標簽，浸入液氮30 min后放入-80℃超低溫冰箱冷凍待測。

1.3主要試劑 Akt絲氨酸473磷酸化〔p-Akt (Ser473)〕抗體、p70S6K蘇氨酸389磷酸化〔p-p70S6K(Thr389)〕抗體，細胞信號公司(波士頓，美國)，二抗及其他試劑，碧云天(南京，中國)。

1.4Western印跡檢測肌肉蛋白含量 取50 mg腓腸肌放入小燒杯中，加入1 ml提前預冷的勻漿介質〔210 mmol/L甘露醇，70 mmol/L蔗糖，5 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.5 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，10 mmol/L氟化鈉(NaF)，pH 7.5〕，剪碎肌組織，去除結締組織、脂肪等。電動勻漿，轉速1 500～1 800 r/min，使組織勻漿化。勻漿液倒入離心管，12 000 g 4℃離心5 min；吸取上清即總蛋白樣品，BCA法測蛋白濃度，換算成單位重量肌肉蛋白含量。抗體稀釋: p-Akt (Ser473) 1∶1 000:p-p70S6K(Thr389)1∶1 000。蛋白表達值為條帶的灰度值，以內參微管蛋白(tubulin)校正。

1.5RT-qPCR 按照Trizol Reagent液說明書提取總RNA。2 μg RNA逆轉錄后執行qPCR(ABI7500，美國)，反應使用協同熒光染料(SYBR-Green Master Mix，TaKaRa，中國)，引物根據以往文獻設計〔12〕:成肌分化抗原(MyoD):正義鏈5′-CCTACTACAGTGAGGCGTCCA-3′，反義鏈5′-GTGGAGATGCGCTCCACTAT-3′(97 bp)；肌形成蛋白(MyoG):正義鏈5′-AGTGAATGCAACTCCCACA-3′，反義鏈5′-CGTAAGGGAGTGCAGGTTGT-3′ (129 bp)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH):正義鏈5′-AGATGGTGAAGGTCGGAGTG-3′,反義鏈5′-GAAGGTCAATGAAGGGGTCA-3′ (117 bp)。PCR 條件：40循環95℃ 15 s，61℃(MyoD) 或60℃(MyoG)。GAPDH為內參，相對表達量2-△△Ct。

1.6統計學處理 采用SPSS12.0進行雙因素方差分析、SNK檢驗。

2 結 果

2.1肌肉質量和蛋白含量 T組腓腸肌重量及蛋白含量顯著高于C組(P<0.05)；T+R組腓腸肌重量及蛋白含量顯著高于C組，但顯著低于T組(P<0.05)；R組腓腸肌重量及蛋白含量與C組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組p-Akt、p-p70s6k、MyoD mRNA、MyoG mRNA、MyoD mRNA/MyoG mRNA比較 與C組比較，T組、R組、T+R組p-Akt顯著升高(P<0.05)，T組、T+R組p-Akt顯著高于R組(P<0.05)；與C組比較，T組、T+R組p-p70s6k、MyoD mRNA、MyoG mRNA顯著升高,R組顯著降低(P<0.05)，T組、T+R組p-p70s6k、MyoD mRNA、MyoG mRNA顯著高于R組(P<0.05)；T+R組p-p70s6k、MyoD mRNA、MyoG mRNA顯著低于T組(P<0.05)。與C組比較，T組、R組、T+R組MyoD mRNA/MyoG mRNA顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組腓腸肌的重量和蛋白含量及Akt、mTOR和生肌因子水平

圖1 各組p-Akt、p-p70s6k蛋白表達

3 討 論

骨骼肌質量的改變(肥大或萎縮)影響著人體或動物的整體運動能力和健康水平，訓練(強度依賴性的)誘導肌肉肥大已有報道，而CR的作用則更為復雜——抑制衰老〔14，15〕、氧化應激〔16〕誘發的肌肉萎縮，但對于正常成體肌肉的作用，是引起萎縮〔17〕與否〔8〕，報道并不一致。本研究顯示，CR不會降低肌肉量(以體重校正)，但會削弱了運動誘導的肌肉肥大。從生物學意義和發展方向來看，運動的“前景”是“更強”，而CR的前景是“維持”，從需求來看，運動訓練是“高能模式”，需要攝取更多熱量保持最強狀態，而CR進入“省電模式”，減少維持生命之外的一切不必要的能量“開銷”，故二者從需求、發展的方向上存在矛盾，這也導致了結果上的折中——聯合組肌肉量增長的放緩。考慮到炎癥誘發的脂肪填充、水腫會導致肌肉質量虛高，本研究測試了肌肉蛋白含量，結果顯示，各處理組蛋白含量均未降低，排除上述誤判的可能。

Akt/mTOR通路在蛋白翻譯(上調翻譯起始和核糖體生物發生)中作用關鍵〔13〕。Akt在慢性訓練后激活〔18～20〕，CR對Akt、mTOR的作用是降低與否存在爭議〔1，11〕，可能與CR強度、時間、采樣組織有關。本研究提示mTOR依賴性的蛋白翻譯對在3種肌肉質量干預中都起重要作用。其中，CR組肌肉量改變與mTOR略有差異的原因可能是CR后分解代謝也在降低，部分抵消了mTOR的作用。Akt活性(p-Akt)的改變和mTOR不一致，在3個處理組均升高。Akt的改變可以解釋mTOR活性在運動后的上調，但無法解釋該指標在CR后降低及“運動+CR”后升高減緩。這可能與mTOR的另一個重要調控劑AMPK負調控〔21〕有關，CR和運動均能夠激活AMPK〔22，23〕，3個處理組中，mTOR的波動反映了AMPK、Akt的博弈，也因此，可能導致這與Akt同步性較弱。

生肌因子MyoD與MyoG在激活肌肉特異性基因轉錄(前者對應快肌纖維基因、后者對應慢肌纖維基因)中起關鍵作用，是主要生肌信號的效應器〔24～26〕。二者比值是肌纖維的“快-慢”轉化的重要標志〔24～26〕。本研究發現，改變趨勢，MyoD mRNA與MyoG mRNA二者均與p-p70s6k(mTOR激活標志)一致，提示，各處理后mTOR依賴性的蛋白翻譯的改變至少部分要歸因于MyoD 和MyoG 依賴性的基因轉錄的波動。MyoD/MyoG在各處理組均降低，提示，運動、CR及“運動+CR”均使肌纖維發生“快-慢”的轉化。纖維類型轉化方向標志肌肉適應的側重，快肌纖維收縮的力量大、速度快，慢肌纖維有氧代謝能力強、耐力強、更利于自身存活和組織健康〔25，27〕。本研究結果提示，慢性大強度耐力運動的作用是在快慢纖維同時發展基礎上，優先發展慢肌纖維，即優先改善耐力和生存，類似情況的是“運動+CR”，差異僅是肌纖維增長均有所減緩，而CR的效果則是在抑制快和慢肌纖維生長基礎上，優先保護慢纖維，即放棄力量和速度換取生存和耐力。

綜上，慢性CR不會降低肌肉質量(以體重校正)，但會阻礙運動性肌肉肥大。mTOR介導的蛋白翻譯在運動、CR和二者聯合對肌量的調控中可能有關鍵作用，且生肌因子MyoD和MyoG 也參與了該調控的介導。CR未降低肌肉質量可能是分解代謝降低部分抵消了合成代謝降低的效果。Akt在干預誘導的mTOR的改變中可能與AMPK負協同。運動、CR和二者聯合均讓肌肉向“慢”轉化，區別是，運動和聯合處理均是肌量增長前提下的轉化，而CR是肌量基本保持不變下的轉化。條件所限，本文仍有一些問題需要在未來解決：第一，因素之間的因果關系推論需要進一步確認(通過阻斷、激動等方式)；第二，一些更直接指標有待補充，如ATP的產量及肌纖維類型轉化、細胞凋亡與自噬的組織學和形態學指標等；第三，其他類型肌肉反應可能有差異，如比目魚肌(慢纖維為主)，有待研究。