大鼠骨骼肌挫傷修復過程中p38MAPK通路、炎癥反應的作用

王嶼萌 廖苾芝 周達岸

(錦州醫科大學附屬第三醫院康復中心，遼寧 錦州 121000)

骨骼肌鈍挫傷是由急性、機械性的頓力造成的損傷，隨之產生炎癥反應，并導致氧化應激水平發生變化，其特征是皮膚無破損，無外部損傷〔1〕。骨骼肌損傷修復主要源于肌衛星細胞的增殖分化，從原有骨骼肌中進行分離培養獲得的肌衛星細胞增生細胞在體外進行培養時被人們統稱其為成肌細胞,這類細胞在機體未受到傷害或刺激時仍然處于正常靜止活動狀態,損傷或突變發生時會被激活,具備自我復制和增殖多向細胞分化的巨大潛能,可以進一步進行增殖單向分化，修復受損肌組織，達到治療效果〔2,3〕。已有研究表明p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑在骨骼成肌細胞的生長中起著重要作用，在成肌細胞增殖與分化中扮演重要角色〔4〕。沖擊波(ESW)是近幾年興起的對肌肉骨骼系統疾病有效的一種新興治療技術，ESW能夠有效影響細胞增殖與分化，抗炎，擴張血管及血管生成，緩解疼痛，神經修復與再生，加速成骨〔5～10〕。為此本實驗首次以ESW作為干預手段，研究p38MAPK信號通路及炎癥因子在骨骼肌鈍挫傷修復時的表達變化，探討利用ESW對急性骨骼肌鈍挫傷的修復治療機制作用及其機制,為臨床治療骨骼肌損傷修復提供科學依據。

1 材料與方法

1.1動物與分組 于錦州醫科大學IVC動物實驗室購買60只健康飼養雄性SD大鼠，8～9 周齡，體重180～200 g，飼養溫度控制在20～25℃，濕度40%～50%，動物飼養生產經營許可證注冊號：SCXK(遼)2017-0003。60只大鼠隨機分為正常組(n=12)、損傷組(n=24)和治療組(n=24)，其中損傷組與治療組，每組按照1 d、3 d、7 d、14 d時間點分為4個亞組。實驗操作符合錦州醫科大學實驗動物倫理與福利委員會章程。

1.2主要試劑和儀器 p-38MAPK一抗 、肌細胞生成素(Myogenin)一抗、β-actin(美國，abcam)，磷酸化(p)-p38MAPK一抗(美國，CST)，山羊抗兔二抗(上海，碧云天)，酶聯免疫吸附試驗試劑盒(上海，酶聯生物)，Western印跡相關試劑(上海，碧云天)，光學顯微鏡(日本，Olympus公司)，電泳及轉膜儀器(美 國，BIO RAD 公司)，凝膠成像系統(美國，BIO RAD公司)，體外沖擊波治療儀(瑞士，EMS公司)。

1.3急性鈍挫傷模型建立 依照Liu等〔11〕方式，采用自置重物裝置打擊腓腸肌肌腹。打擊物重 16.8 g(直徑15.9 mm)，下落高度125 cm，打擊頭面積約28.26 mm2。這種方法導致的損傷是一種高效鈍性創傷，伴隨著炎癥細胞侵入，之后廣泛的肌肉再生〔12〕。各組于不同時間點(第1、3、7、14天)取腓腸肌肌腹。

1.4治療措施及取材 正常組未給予干預；損傷組不給予治療；治療組大鼠于損傷后24 h采用發散式沖擊波刺激，作用于大鼠腓腸肌中段。設定參數〔13〕：能流密度0.14 mJ/mm2，頻率10 Hz，每次沖擊500次，每間隔4 d進行1次治療，于1 d、3 d、7 d、14 d時取大鼠局部腓腸肌進行檢測(其中1 d取材時于治療結束后即刻進行)。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色組織學觀察 將腓腸肌肌腹固定在4%的多聚甲醛1 h后，石蠟包埋切片(5 μm)并HE染色，在光鏡下觀察組織病理學改變并采集圖像。

1.6Western印跡法 每組分別取100 mg樣本，加入適量高效RIPA裂解液，加入100 μl的pH為7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用勻漿器充分勻漿，離心取上清液并進行蛋白定量。電泳開始以90 V恒壓1 h，待擴散后，120 V恒壓2 h，進行轉膜(濕轉)，用300 mA恒流1.5 h，電泳后，將膜放入5%脫脂奶粉溶液中1.5 h，TBST洗膜后分別在p38MAPK(1∶1 000)、p-p38MAPK(1∶1 000)、Myogenin(1∶500)、β-actin(1∶1 000)一抗稀釋液中4℃搖床孵育過夜；放入二抗(1∶1 000稀釋)在室溫下放置1 h；電化學發光(ECL)顯影后成像。Image J 軟件分析每個目的蛋白灰度值。

1.7酶聯免疫吸附試驗 取凍存于-80℃冰箱中的血清，按試劑盒說明書依次加入空白孔、標準孔和樣品孔，除空白孔，其余孔加酶標試劑，密封，37℃孵育60 min。配制溶液，清洗，依次向每個孔中加入顯色劑A和B，輕輕搖勻，顯色，然后加入終止液。在450 nm波長下測量每個孔的吸光度(OD值)。

1.8統計學分析 采用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析和LSD檢驗。

2 結 果

2.1肌肉形態 正常組：肌肉組織結構正常完整，肌纖維走形整齊，無組織變性、壞死等明顯病理結構改變。損傷組較正常組：肌纖維排列紊亂，炎癥細胞浸潤。治療組較損傷組：隨著治療進展，肌纖維排列較規則，炎細胞減少。見圖1。

2.2各組p38MAPK、p-p38MAPK、Myogenin表達比較 損傷組和治療組的p38MAPK、p-p38MAPK、Myogenin表達量均高于正常組(P<0.01)，同一時間點下，治療組p38MAPK、p-p38MAPK、Myogenin的表達量相對于損傷組均顯著增高(P<0.05)，損傷組和治療組p38MAPK、p-p38MAPK、Myogenin均在3 d表達量達到峰值(P<0.01)。見表1、圖2。

圖1 不同組別腓腸肌HE染色(×200)

表1 各組p38、p-p38、Myogenin蛋白及TNF-α、IL-1β含量比較

1～9：正常組，損傷1、3、7、14 d組，治療1、3、7、14 d組

2.3炎性細胞因子水平 損傷組各個時間點TNF-α、IL-1β的表達量與正常組比較均有顯著性差異(P<0.01)，且均在損傷1 d達高峰(P<0.05)。治療組TNF-α、IL-1β相對于損傷組除第1天增高(P<0.05)，3 d、7 d、14 d都呈下降趨勢且具有統計學意義(P<0.01)。見表1。

3 討 論

ESW作為一種新型治療技術，具有高效、安全、多用途、可重復、無創等特點，近年來，廣泛應用于治療許多肌肉骨骼疾病之中〔14〕。ESW作為一種具備力學性質的機械波〔15〕，通過機械傳導，以誘導新血管生成和干細胞活動，從而改善組織再生和愈合。已證明ESW上調Myogenin的表達，促進急性骨骼肌損傷后再生〔16〕。同時，也有研究表明ESW在體外實驗對成肌細胞具有一定促進增殖與分化作用〔17〕。p38MAPK信號通路在促進成肌細胞分化、肌管生成、衛星細胞增殖方面都發揮著重要作用〔18，19〕。雖然沒有研究表明ESW對MAPK激活的影響，但上述所有研究都表明，ESW可以通過激活p38MAPK途徑來促進骨骼肌衛星細胞增殖的可能性。且體外成肌細胞不能完全代替體內肌衛星細胞， 成肌細胞和肌衛星細胞之間在細胞成熟水平方面存在顯著差異〔20〕。 本研究結果表明ESW通過促進p38MAPK表達進而直接調節MAPK級聯反應，致使磷酸化，從而調節肌細胞增殖。通過促進Myogenin增殖即提高肌源性調節因子表達〔21〕，達到組織愈合目的。炎癥細胞因子在骨骼肌修復再生的中也起著至關重要的作用，雖然抗炎策略的發展已被廣泛認為是提供組織拯救的主要工具，但也必須記住，及時實施促炎模式在組織修復中也起著關鍵作用〔22〕。近年來，觀察到ESW能通過上調人牙周膜中IL-6和TNF-α的表達水平，促進成纖維細胞增殖〔23〕。眾所周知，在應激期間，細胞會發生各種反應，包括炎癥反應。本研究發現ESW的作用可以初期觸發促炎癥因子的激活，ESW啟動的機械轉導可能通過促炎誘導促進肌衛星細胞的增殖，然而長期炎癥反應損害機體修復，導致瘢痕增生，是促炎與抗炎失調〔24〕，為此本實驗結果表明ESW后期治療整體都是下降的。根據這些觀察，ESW可能初期刺激炎癥因子的活性也就可以理解了，所有這些結果表明，ESW可能正向調控骨骼肌修復過程的初始有益炎癥反應〔25〕，并使肌衛星細胞增殖與分化“合理化”。

綜上，經ESW預后，p38MAPK信號通路被更大程度激活，調控 Myogenin表達增加，增強骨骼肌再生修復。同時減輕炎癥反應，促進修復愈合過程。ESW可通過p38MAPK信號通路促進肌衛星細胞增殖，同時減輕炎癥反應，到達治療目的，ESW在減輕肌肉挫傷的炎癥和促進肌生成方面具有雙重作用。