LncRNA LINC00261靶向miR-182-5p對腦膠質瘤細胞替莫唑胺耐藥性的影響及其機制

陳彬 徐廷偉

(湖北文理學院附屬醫院 襄陽市中心醫院神經外科，湖北 襄陽 441021)

腦膠質瘤是一種比較常見的原發性顱腦腫瘤，其由大腦和脊髓膠質細胞癌變所產生。因其為不能完全切除的原發性腦腫瘤，因此無法完全治愈。臨床常用的標準治療包括手術、放射治療和化療〔1，2〕。盡管進行了這種強化治療，但腫瘤的耐藥性和復發限制了其療效〔3，4〕。替莫唑胺(TMZ)是膠質瘤化療標準的烷基化劑。甲基轉移酶(MGMT)啟動子高甲基化是膠質瘤對TMZ產生耐藥性的機制之一〔5〕。盡管患者生存期得到延長，但治療效果有限，因為膠質瘤往往在治療過程中對TMZ表現出適應性耐藥。因此，針對耐藥膠質瘤的治療具有重要的臨床治療意義。人類基因組中僅有不到2%編碼成蛋白質，超過90%的基因組轉錄為非編碼RNA〔6〕。LncRNA被定義為一類長度超過200個核苷酸(nt)的非編碼RNA轉錄本，其不具有完整的開放閱讀框。有證據表明，LncRNA在多種生物學過程中發揮作用，包括癌細胞的耐藥〔7，8〕。 LncRNA LINC00261參與多種癌癥的耐藥性調控〔9〕，但是其在腦膠質瘤中是否對耐藥性具有調控作用尚且未知。本研究擬以膠質瘤細胞U251為研究對象，觀察LINC00261對其TMZ耐藥性的影響，旨在探討LINC00261增強TMZ耐藥膠質瘤細胞對TMZ敏感性的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 組織標本收集于襄陽市中心醫院2018年3月至2019年6月外科手術切除的腦膠質瘤標本20例，腦外傷內減壓切除的正常腦組織20例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及家屬均簽署知情同意書；膠質瘤細胞U251購自中國科學院細胞庫；胎牛血清(FBS)購自四季青；DMEM培養基購自上海聯碩生物公司；替莫唑胺購自山東中天；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑購自Sellect公司；RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自大連TaKaRa公司；Transwell小室均購自Corning公司；LipofectamineTM2000試劑、電化學發光(ECL)液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 膠質瘤細胞株U251的培養：含有10% FBS的DMEM培養基，37℃，5%CO2的細胞培養箱中常規培養，傳代。

1.2.2細胞分組與處理 將正常培養的U251細胞標記為U251組。將U251細胞按照陸芩等〔10〕的濃度梯度法建立TMZ耐藥U251細胞，標記為U251/TMZ組。將TMZ(5、10、20、40、80 μg/ml)處理U251、U251/TMZ細胞48 h，分被標記為5、10、20、40、80 μg/ml組，從中篩選最適濃度10 μg/ml用于后續試驗。用脂質體LipofectamineTM2000試劑，加入4倍DNA或質粒體積的脂質體，將pcDNA、pcDNA-LINC00261、anti-miR-NC、anti-miR-182-5p、pcDNA-LINC00261+miR-NC、pcDNA-LINC00261+miR-182-5p轉染至U251/TMZ細胞，轉染4 h后，更換新鮮培養基繼續培養48 h，并用10 μg/ml TMZ處理48 h，用qRT-PCR法檢測轉染的效率，確定轉染成功后，分別標記為TMZ+pcDNA組、TMZ+pcDNA-LINC00261組、TMZ+anti-miR-NC組、TMZ+anti-miR-182-5p組、TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-NC組、TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-182-5p組，用于后續試驗。將miR-NC、miR-182-5p、si-NC、si-LINC00261用同樣的方法轉染至U251細胞，分別標記為miR-NC組、miR-182-5p組、si-NC組、si-LINC00261組。

1.2.3qRT-PCR法檢測細胞中LINC00261、miR-182-5p的表達 收集細胞，用RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒獲得cDNA。再用qRT-PCR試劑盒檢測各個樣品中LINC00261、miR-182-5p的表達，以GAPDH、U6為內參，2-△△Ct計算LINC00261、miR-182-5p的相對表達。引物信息：LINC00261上游引物5′-ACATTTGGTAGCCCCTGGAG-3′，下游引物5′-TCTTCCCCGGAGAACTAGCA-3′；miR-182-5p上游引物5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′，下游引物5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GADPH上游引物5′-CCACCCAGAAGACTGTGGAT-3′，下游引物5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′。

1.2.4MTT法檢測細胞抑制率 收集細胞，調整至5×105個/ml，取100 μl接種至96孔板，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培養4 h。盡量棄去上清，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩混勻至結晶紫溶解。調整酶標儀至490 nm波長，檢測細胞的吸光度(A)。細胞的抑制率=〔1-A490樣品/A490對照〕×100%。

1.2.5Transwell小室檢測細胞遷移侵襲 選用含有基質膠的Transwell小室進行細胞的侵襲檢測，不含基質膠的Transwell小室進行細胞的遷移檢測，二者的操作步驟相同。操作步驟為：先將細胞用無血清培養基培養24 h，收集細胞，調整至5×106個/ml。取200 μl細胞加入小室的上室內，取600 μl含血清的培養基加入小室的下室，將小室置于培養箱中培養48 h。準備甲醇固定液和結晶紫染色液備用。小心取出小室，用棉簽輕輕拭去聚碳酸酯膜上表面的細胞，然后將膜轉移至固定液中，30 min。將膜浸入染色液中染色15 min，用鑷子輕輕將膜下表面朝上在載玻片上固定。用顯微鏡觀察細胞的數量(×200)，取平均值。

1.2.6Western印跡檢測細胞中細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21的蛋白表達 收集細胞并用含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液裂解，提取用蛋白后用BCA法進行蛋白定量，再用沸水浴10 min行變性處理。小心加樣后，調節電壓60 V進行穩壓電泳，約40 min，電壓調整至120 V進行穩壓電泳，1.5～2.0 h結束。結束后，將蛋白用轉膜儀濕轉至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，轉膜過程需要低溫環境下操作。轉膜結束后進行脫脂奶粉(5%)封閉、一抗孵育(兔抗人多克隆抗體CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21)、二抗孵育(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體)。將膜轉移至暗室內，用ECL試劑進行顯影、定影、曝光，用Quantity One凝膠分析軟件分析條帶的灰度值，以GAPDH為內參，目的條帶灰度值與內參灰度值的比值表示目的蛋白的表達情況。

1.2.7生物信息學預測 通過在線靶基因預測庫Target Scan(http：//www.targetscan.org/)預測LINC 00261的靶向結合位點。

1.2.8雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細胞中LINC00261與miR-182-5p的結合能力 收集細胞，裂解液將細胞充分裂解，再加入5 μl的熒光素酶緩沖液和底物，混合均勻后測量熒光強度，再加入海參熒光素酶緩沖液和底物，混勻檢測海參熒光強度。實驗重復3次，每個樣本做3個復孔。最后比較海參熒光素酶的強度，表達LINC00261與miR-182-5p的結合能力。值得注意的是，實驗中以為psiCHECK2載體，螢火蟲熒光素酶為內參，psiCHECK2-LINC00261-野生型(WT)+miR-NC、psiCHECK2-LINC00261-突變型(MUT)+miR-NC為對照，觀察miR-182-5p對LINC00261表達的影響。

1.3統計學方法 采用GraphPad Prism6.0進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1LINC00261和miR-182-5p在膠質瘤組織和正常腦組織中的表達 見表1，與正常腦組織相比，膠質瘤組織中LINC00261表達顯著降低，miR-182-5p表達顯著升高(均P<0.001)。

2.2LINC00261和miR-182-5p在膠質瘤細胞和膠質瘤TMZ耐藥細胞中的表達 見表2，與U251組相比，U251/TMZ組細胞中LINC00261表達顯著降低，miR-182-5p表達顯著升高(均P<0.001)。

2.3不同濃度替莫唑胺對膠質瘤細胞和膠質瘤替莫唑胺耐藥細胞抑制率的影響 結果如表3所示，與U251組相比，U251/TMZ組細胞在替莫唑胺濃度為5、10、20、40、80 μg/ml的抑制率均顯著降低，IC50值顯著升高(P<0.05)。

表1 LINC00261和miR-182-5p在膠質瘤組織和正常腦組織中的表達

表2 LINC00261和miR-182-5p在膠質瘤細胞和膠質瘤TMZ耐藥細胞中的表達及不同濃度TMZ對膠質瘤細胞和膠質瘤TMZ耐藥細胞抑制率的影響

2.4LINC00261過表達聯合TMZ(10 μg/ml)對U251/TMZ細胞增殖、遷移侵襲的影響 與TMZ+pcDNA組相比，TMZ+pcDNA-LINC00261組細胞中LINC00261表達顯著升高，細胞抑制率顯著升高，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著降低，p21蛋白表達顯著升高(均P<0.001)。見圖1、表3。

2.5抑制miR-182-5p表達聯合TMZ對U251/TMZ細胞增殖、遷移侵襲的影響 與TMZ+anti-miR-NC組相比，TMZ+anti-miR-182-5p組細胞中miR-182-5p表達顯著降低，細胞抑制率顯著升高，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著降低，p21蛋白表達顯著升高(均P<0.001)。見圖2、表4。

A：增殖、遷移侵襲相關蛋白表達；B：U251/TMZ細胞的遷移侵襲(結晶紫，×200)；圖2同

表3 LINC00261過表達聯合TMZ對U251/TMZ細胞增殖、遷移侵襲的影響

圖2 抑制miR-182-5p表達聯合替莫唑胺對U251/TMZ細胞增殖、遷移侵襲的影響

表4 抑制miR-182-5p表達聯合替莫唑胺對U251/TMZ細胞增殖、遷移侵襲的影響

2.6LINC00261靶向調控miR-182-5p的表達 通過在線預測軟件target scan預測到LINC00261與miR-182-5p之間存在互補的結合位點(圖3)。

圖3 LINC00261的序列中含有與miR-182-5p互補的核苷酸序列

與miR-NC組相比，miR-182-5p組WT-LINC00261細胞的熒光活性顯著降低(表5)。與pcDNA組(1.00±0.09)相比，pcDNA-LINC00261組細胞中miR-182-5p表達(0.41±0.08)顯著降低，與si-NC組(0.98±0.08)相比，si-LINC00261組細胞中miR-182-5p表達顯著升高(2.35±0.23；F=353.756，P=0.000)。

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.7miR-182-5p過表達逆轉了INC00261過表達對U251/TMZ細胞TMZ耐藥性的作用 與TMZ+pcDNA組相比，TMZ+pcDNA-LINC00261組細胞中miR-182-5p表達顯著降低，細胞抑制率顯著升高，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著降低，p21蛋白表達顯著升高；與TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-NC組相比，TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-182-5p組細胞中miR-182-5p表達顯著升高，細胞抑制率顯著降低，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著升高，p21蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表6、圖4、圖5。

表6 miR-182-5p過表達逆轉了INC00261過表達對U251/TMZ細胞TMZ耐藥性的作用

圖4 U251/TMZ細胞的遷移侵襲(結晶紫，×200)

1～4:TMZ+pcDNA、TMZ+pcDNA-LINC00261、TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-NC、TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-182-5p

3 討 論

化療是癌癥的基本治療手段之一，然而，臨床治療失敗的主要原因是化療耐藥的產生。藥物外排、DNA損傷修復、細胞凋亡、靶基因突變等多種因素相互作用，導致耐藥機制復雜〔11〕。LncRNA一直是生物科學領域的研究熱點，最新研究表明，LncRNAs在乳腺癌、胃癌、肺癌等腫瘤的耐藥性中發揮著重要作用〔12〕。LINC00261是一種LncRNA，其在腫瘤抑制中發揮重要作用〔13〕。Shi等〔14〕在非小細胞肺癌的研究中報道，LINC00261在癌組織中的表達異常下調，并與患者的預后差呈正相關，在癌細胞中過表達LINC00261能夠抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲，深入研究發現，LINC00261可靶向抑制LINC00261，抑制Wnt信號通路的活性進而參與非小細胞肺癌的致病機制。Lin等〔15〕在研究中報道，抗氟尿嘧啶的食管癌中LINC00261表達降低，過表達LINC00261的氟尿嘧啶耐藥食管癌細胞中，細胞的增殖受到明顯抑制，凋亡能力明顯提升，沉默LINC00261的氟尿嘧啶耐藥食管癌細胞則可增強癌細胞的增殖和抗凋亡能力，這提示LINC00261可能成為治療耐藥食管癌的新靶點。我們推測LINC00261可能也參與抗癌藥物TMZ在膠質瘤中的耐藥性調控。本研究通過RT-qPCR法檢測了膠質瘤組織、膠質瘤細胞、TMZ耐藥膠質瘤細胞中LINC00261的表達，發現LINC00261在膠質瘤中表達異常下調，在耐藥膠質瘤細胞中的表達下調更明顯，可見，LINC00261在耐藥膠質瘤中的表達情況與其在氟尿嘧啶耐藥食管癌中的表達情況相類似。進一步研究，用MTT、Transwell小室、Western印跡實驗檢測過表達LINC00261的TMZ耐藥膠質瘤細胞的抑制率、遷移侵襲及相關蛋白表達，發現過表達LINC00261可提高耐藥癌細胞的抑制率，抑制耐藥癌細胞的遷移侵襲，下調CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達，上調p21蛋白表達，可見，過表達LINC00261能夠增強TMZ耐藥膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性。深入研究，通過生物信息學預測、雙熒光素酶報告基因檢測實驗發現，LINC00261可靶向負調控miR-182-5p，推測LINC00261增強TMZ耐藥膠質瘤細胞的敏感性的機制可能與miR-182-5p具有相關性。

miRNA在人類多種疾病中通過抑制靶基因的轉錄或蛋白翻譯參與疾病的發生發展過程〔16，17〕。Xue等〔18〕在膠質瘤的研究中發現，STAT3的異常激活或表達降低分別促進或抑制miR-182-5p的表達，并且腫瘤抑制因子procadadherin-8(PCDH8)是miR-182-5p的候選靶基因，膠質母細胞瘤組織中PCDH8的表達水平與磷酸化信號傳導與轉錄激活因子(p-STAT)3或miR-182-5p呈負相關，說明miR-182-5p在膠質瘤中發揮促進癌癥惡化的作用。Cao等〔19〕在肝癌的研究中報道，miR-182-5p能夠促進肝癌的惡性化進展，其機制與靶向叉頭轉錄因子(FOX)O3a相關，推測miR-182-5p在膠質瘤中可能可靶向FOXO3a參與膠質瘤的進展過程。史俊英等〔20〕在胃癌的研究中發現，抑制miR-182-5p能夠增強氟尿嘧啶耐藥胃癌細胞對氟尿嘧啶的敏感性。本研究中檢測了膠質瘤組織、膠質瘤細胞、替莫唑胺耐藥膠質瘤細胞中miR-182-5p的表達，發現miR-182-5p表達明顯上調，且抑制miR-182-5p能夠明顯的提高TMZ對耐藥膠質瘤細胞的抑制率，增強TMZ對耐藥膠質瘤細胞的抗遷移侵襲作用，可見，抑制miR-182-5p能夠增強TMZ對耐藥膠質瘤細胞的敏感性，這與抑制miR-182-5p在氟尿嘧啶耐藥胃癌細胞中的增敏作用相似。重要的是，我們還發現，過表達miR-182-5p能夠逆轉LINC00261對TMZ耐藥膠質瘤細胞抑制率、遷移侵襲的作用。這些研究結果為TMZ耐藥膠質瘤的治療提供了潛在的治療靶點，遺憾的是，我們本在體內對這些結果進行更充分的驗證。

綜上所述，LncRNA LINC00261可逆轉TMZ耐藥膠質瘤細胞對替莫唑胺的耐藥性，其機制可能與靶向miR-182-5p有關，為耐藥膠質瘤的治療提供新方向。