慢性應激刺激對大鼠血壓相關代謝物的影響

李娜 趙紅霞

摘要：目的：檢測慢性應激高血壓大鼠頭端延髓腹外側區組織中腺苷、cAPM含量的變化，探討慢性應激下高血壓的病理機制。方法：將12只大鼠隨機分成Sham組、CS組，采取4周反復刺激構建慢性應激高血壓模型，采用超高效液相色譜串聯質譜法測定大鼠RVLM區腺苷、cAPM的變化。結果：與Sham組相比，CS組血壓升高，腺苷、cAPM含量下調（P<0.01）。結論：本實驗成功構建了慢性應激高血壓大鼠模型，慢性應激條件下腺苷、cAPM含量下調可能是高血壓發生與發展過程中的關鍵因素。

關鍵詞：慢性應激;高血壓;腺苷;cAPM;動物模型

高血壓是引起心腦血管疾病的重要因素[1]，隨著經濟的發展，人們承受的慢性應激也越來越大，這些壓力的持續存在給人們帶來了嚴重傷害[2]。本實驗采用超高效液相色譜串聯質譜法對慢性應激高血壓大鼠頭端延髓腹外側區（Rostral Ventrolateral Medulla， RVLM）的腺苷、cAMP進行測定，初步探討在慢性應激所致高血壓發展過程中血管舒張因子的含量變化情況，揭示慢性應激狀態下高血壓復雜的病理機制。現報道如下：

1材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290 Infinity HpLC與6470 TQ MS/MS（安捷倫科技，美國），雙極銀絲記錄電極（北京旭月科技有限公司），示波器（美國Tektronix oscilloscoPe公司），腺苷、cAMP和醋酸銨均購自Sigma（St. Louis， Missouri， USA），氨水購自泰坦科技股份有限公司，乙腈（色譜純，默克公司），水為超純去離子水（18.2 M）。

1.2 動物模型的建立

8周齡SPF級SD雄性大鼠12只，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016。動物飼養嚴格按照國家實驗動物飼養和使用指南進行。適應性飼養1周后隨機分成Sham組、CS組，每組6只。慢性應激高血壓大鼠模型參照相關文獻[3]。Sham組除不給予應激刺激外，其他條件與CS組相同。

1.3 血壓測定與樣本收集

血壓測定參照相關文獻進行[4]。測量結束后，大鼠行安樂死。斷頭取出RVLM區組織，-80℃冰箱保存。

1.4 色譜質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱HyPercarb Column（3 μm，2.1×100 mm，Thermo Fisher Scientific），柱溫35℃。流動相15mM醋酸銨-0.3%氨水（A）-15mM醋酸銨-0.3%氨水-90%乙腈（B），Posttime 3 min。洗脫梯度：0～2 min，3%B;2～10 min，3%～50%B;10～14 min，50%～85%B，14～17 min，85%。流速0.35 ml/min，進樣量1 μl。

1.4.2 質譜條件

ESI+動態MRM模式，Gas TemP 350℃，Gas Flow 10 L/min，Nebulizer 40 Psi，SheathGasHeater 350℃，SheathGasFlow 11 L/min，CaPillary 4 000 V，其他參數見表1，色譜圖見圖1。

1.5 標準品的配制

精密稱取標準品10 mg，置于容量瓶中，加入水，配制約1 mg/ml的標準品儲備液。

1.6 樣品的前處理

精密稱取腦組織，加入200 μl甲醇勻漿（60 Hz，60 s）后，離心15 min（12000 g，4℃），取上清液待測。

1.7 統計學方法

采用SPSS21.0對數據進行處理，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1 兩組大鼠血壓比較

經4周慢性應激之后，CS組血壓顯著升高（P<0.01），符合慢性應激高血壓的表現。見表2。

2.2 腺苷、cAMP含量測定

2.2.1 線性方程的建立

取標準品儲備液，用50%甲醇稀釋，按1.4項下進行測定，以濃度為橫坐標，以峰面積作為縱坐標繪制標準曲線，結果顯示不同濃度腺苷、cAMP與峰面積均具有良好的線性關系，相關系數大于0.999。見表3。

2.2.2 精密度

測定低、中、高濃度腺苷、cAMP，計算精密度。腺苷精密度為0.48%～1.65%（n=6），cAMP精密度為0.96%～3.21%（n=6），說明方法精密度良好。

2.2.3 測定結果

將腦組織按照1.6項下處理，按1.4項下進行測定，結果顯示CS組腺苷和cAMP的含量較Sham組顯著下調（P<0.01）。見表4。

3討論

腺苷具有舒張血管、對抗室上性心動過速的作用。研究表明，腺苷與血流量大小密切相關，可通過與血管平滑肌的直接作用使血管舒張，血壓下降[5]。此外，腺苷可通過腺苷受體A2介導的Gαs使cAMP發生變化[6]。在本實驗中，CS組腺苷和cAMP均下調，提示慢性應激所致的高血壓可能與MAPK磷酸化程度相關。

本研究通過對腺苷、cAMP的靶向檢測，初步推斷CS所致高血壓可能與腺苷、cAMP的下調相關，并為今后研究慢性應激性高血壓的病理機制提供一定參考。

參考文獻

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[5]Marshall JM.The roles of adenosine and related substances in exercise hyPeraemia[J].J Physiol，2007，583（Pt 3）：835-845.

[6]Schulte G，Fredholm BB.Signalling from adenosine recePtors to mitogen-activated Protein kinases[J].Cell Signal，2003，15（9）：813-827.