基于2b-RAD簡化基因組測序的三門灣海域3種優勢魚類群體遺傳多樣性分析

王星火，常雪晴，程方平，馬路闊，徐旭丹，王有基，黃 偉

（1.自然資源部第二海洋研究所，自然資源部海洋生態系統動力學重點實驗室，浙江杭州 310012；2.上海海洋大學，國家海洋生物科學國際聯合研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學，水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306）

三門灣位于中國浙江省東部，總面積約775 km2，海岸線總長度304 km，北鄰象山港，南接浦壩港，灣口面向東南，灣內島礁羅列、水道縱橫，是一座近海天然避風良港［1］。三門灣地處亞熱帶季風氣候區，溫暖濕潤，生物餌料資源豐富，有利于魚類產卵和索餌［2］。近年來，隨著三門灣海域及周邊地區人類活動加劇，城鎮化和工業化進程加快，涉海工程和養殖活動增多，對生物群落和水域環境產生一定影響，三門灣漁業資源已呈現出明顯的衰退趨勢［3－4］。因此，亟需對其生物遺傳多樣性現狀及其未來可能對野生魚類群體產生的遺傳學影響展開針對性科學評價。

遺傳多樣性（genetic diversity）是生命進化和物種分化的基礎，是物種多樣性和生態系統多樣性的基礎，也是評價自然生物資源的重要依據［5］。海洋動物種群遺傳多樣性研究具有重要的理論和實際意義，可為評估資源現狀、野生群體保護、養殖群體種質遺傳改良、海洋生態環境修復等工作提供依據［5－6］。近年來，隨著簡化基因組測序技術等新手段不斷發展，有效促進了水產生物資源遺傳多樣性研究水平［7－8］。其中，簡化基因組測序（2b-RAD）技術已逐步成為單核苷酸多態性（SNP）開發最為有效的手段之一，并高效應用于非模式生物尤其是水生生物［9］。該技術主要利用IIB型限制性內切酶，可快速進行全基因組范圍高通量SNP篩查和分析［10］。該技術可獲更多的標記數目，具有更高的分型準確率，可很好地應用于群體遺傳多樣性分析領域［10］。

本研究對三門灣海域生態功能較為重要的3種魚類優勢種進行采集。通過對魚類群體結構和遺傳多樣性進行生物信息分析，評估了三門灣海域漁業資源現狀，以期為海洋生態保護與修復、魚類資源利用與保護等提供理論支撐和科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究于2019年11月（秋季）、2020年2月（冬季）和5月（春季）進行，在三門灣選取20個調查站位，采用漁業資源底拖網開展樣品采集，具體站位布設詳見圖1。從獲取的漁獲物中挑出白姑魚、中華櫛孔蝦虎魚和龍頭魚樣本冷凍保存，運送至實驗室備用。

圖1 三門灣漁業資源調查站位圖Fig.1 Sampling sites of fishery survey in the Sanmen Bay

1.2 DNA提取與檢測

加入10μL蛋白酶K（20 mg·mL－1），在56℃條件下消化，加苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）進行抽提，然后加入2倍體積的無水乙醇進行沉淀［11］。抽提出的DNA進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 2b-RAD文庫構建和測序質量分析

采用2b-RAD五標簽串聯技術構建3種魚類群體的測序文庫［12］。所有樣品采用標準型接頭（BsaXI酶采用5′-NNN-3′接頭）與酶切標簽連接，通過Illumina Hiseq X ten系統進行雙端測序（Paired-end）。得到的原始圖像數據文件經堿基識別轉化成原始測序序列，將拼接好的測序序列進行過濾以保證數據分析結果準確性。根據建庫時各樣品位置提取對應序列，過濾刪除不含酶切識別位點的序列，最后得到各樣品的高質量測序序列。

1.4 SNP分型

利用SOAP軟件（version 2.21）進行測序數據比對［13］，利用最大似然法（ML）進行位點分型［14］。分型工作完成后對分型結果進一步過濾以保證后續分析的準確性。

1.5 數據處理

SNP位點的分型結果處理使用Genepop軟件（Version 1.0.5）［15］。計算物種有效等位基因數（Ne）、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho）、多態信息含量（PIC）等遺傳參數。用vcftools軟件（Version 0.1.14）計算核苷酸多樣性（Pi）和轉換／顛換（Ts／Tv）的比值［16］。使 用plink（Version 1.9）軟件計算1-IBS矩陣（遺傳距離）［17］，vcftools軟件計算哈溫平衡P值［18］。將每個群體內個體SNP標記首尾相連，若缺失相應位點，用“－”替代。

2 結果及分析

基于DNA序列變異的群體遺傳參數分析是衡量群體遺傳結構的主要指標。白姑魚、中華櫛孔蝦虎魚、龍頭魚群體遺傳多樣性參數統計結果見表1。

表1 三門灣海域3種優勢魚類群體遺傳多樣性參數Tab.1 Genetic diversity parameters of three dominant fish populations in the Sanmen Bay

2.1 SNP分型結果及突變類型特點

本研究利用2b-RAD簡化基因組測序技術，分析白姑魚、中華櫛孔蝦虎魚和龍頭魚3種魚類群體的遺傳多樣性參數。發現3種魚類種群均存在較多的SNP位點，其中白姑魚SNP最多（125 225），其余2種魚類SNP位點數量相近，分別是龍頭魚（55 128）、中華櫛孔蝦虎魚（51 283）。3種魚類種群之間SNP數量存在差異，表明在人類活動、環境因素和物種進化歷史等因素影響下，不同的突變位點和發生頻率形成了種群的進化特點［19］。

2.2 遺傳平衡

通過哈溫平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）檢驗群體中等位基因頻率及基因型頻率之間的關系。3種魚類群體哈溫平衡P值均大于0.05，表明其均達到了遺傳平衡。其中，白姑魚群體哈溫平衡P值為0.28，中華櫛孔蝦虎魚群體為0.80，龍頭魚群體為0.68。

2.3 雜合度

分別統計3種魚類群體期望雜合度（He）和觀測雜合度（Ho）。結果顯示，白姑魚觀測雜合度（0.055）＜期望雜合度（0.244），顯示出群體內純合子較多，雜合子缺失；而中華櫛孔蝦虎魚觀測雜合度（0.230）＞期望雜合度（0.210），龍頭魚觀測雜合度（0.302）＞期望雜合度（0.271），顯示出雜合過度。群體的雜合度能夠較準確反映群體遺傳多樣性，觀測雜合度高一般情況下表明群體遺傳多樣性較豐富，研究中3個魚類群體以龍頭魚觀測雜合度最高（0.302），表明龍頭魚相較于其他兩種魚類群體遺傳多樣性更豐富。

2.4 多態信息含量

分別統計3種魚類群體的多態信息含量，對等位基因多態性進行估計，作為衡量DNA變異程度高低的一個指標。多態信息含量顯示，白姑魚（0.208）、中華櫛孔蝦虎魚（0.177）和龍頭魚（0.221）均為低度多態（PIC＜0.25），其中龍頭魚相對于其他2種魚較高。

2.5 有效等位基因數

有效等位基因數可在一定程度上反映群體的變異程度。結果顯示，龍頭魚觀測等位基因數（1.448）最接近有效等位基因數（2），白姑魚、中華櫛孔蝦虎魚次之，表明等位基因在群體中分布均勻程度為龍頭魚＞白姑魚＞中華櫛孔蝦虎魚。

2.6 核苷酸多樣性

核苷酸多樣性常用于衡量群體內或群體間的多樣性，是遺傳變異的一個量化值。核苷酸多樣性指標中，龍頭魚（0.281）＞白姑魚（0.259）＞中華櫛孔蝦虎魚（0.219），表明3種魚類群體中，龍頭魚序列間多樣性最大，白姑魚次之，中華櫛孔蝦虎魚最低。

3 討論

簡化基因組測序技術具有獲得的標記數目更多、分型準確率更高等優勢，已有多個研究將這種方法應用于多個物種的遺傳多樣性研究［7，10，20］。本研究利用該技術分析評價了三門灣3種魚類種群遺傳多樣性水平。SNP堿基替換類型可分成轉換（Ts）與顛換（Tv）兩類，理論上轉換／顛換（Ts／Tv）為0.5，但實際上往往會發生“轉換性偏差”，即轉換／顛換（Ts／Tv）大于1.5［21］。由于不同物種間Ts／Tv存在很大差距，通過對SNP位點特征的分析發現，本研究3種魚類群體的變異位點比例均處于較低水平，轉換／顛換（Ts／Tv）均大于1.5，表明三門灣海域魚類的SNP多態性類型與大多數脊椎動物相似，存在明顯的轉換型偏差現象［22］。本研究中龍頭魚的Ts／Tv為1.61，而白姑魚則達到2.16，這可能與不同物種在進化中承受的選擇壓力不同有關［23］。

物種遺傳多樣性是在長期進化中產生的，也是物種生存發展的基礎［24］。遺傳多樣性可在一定程度上反映環境生物豐富度及演替趨勢。種群進化和歷史因素是遺傳多樣性水平降低的主要原因，地理隔離和近親繁殖會導致群體間基因交流困難，基因豐富度降低，單一化現象嚴重［25］。本研究3種魚類群體變異位點比例、等位基因多態性等遺傳多樣性參數均較低，表明該水域3種定居性優勢魚類群體遺傳多樣性水平均較低，并且同種群個體間的遺傳分化較小，遺傳結構較穩定。推測其原因之一可能是與魚群低齡現象明顯、群體年齡組成簡單有關。研究發現，真鯛（Pagrusmajor）相較于其他魚類具更高比例多態位點和遺傳變異度，可能是由于真鯛具有較長的生命周期、更復雜的野生群體年齡組成，這兩種特質更有利于自然選擇，并可在一定程度上避免近親繁殖和瓶頸效應［26］。近年來，三門灣近岸海域持續呈現富營養化狀態、水體污染嚴重，在一定程度上造成了生態系統退化，加上人類捕撈、養殖活動對生態系統的干擾，導致魚類小型化、低齡化、低值化現象愈發突出［3，31－32］。2014年對三門灣游泳動物進行的調查發現，該海域游泳動物資源密度和豐富度與其他海灣相比均處于較低水平，且春季魚類的幼體比例高達93.99%［3］。本研究同樣發現，三門灣魚類幼體比例處于較高水平（70.97%）。

本研究中白姑魚隸屬鱸形目（Perciformes），石首魚科（Sciaenidae），白姑魚屬，為暖溫性近底層魚類，有明顯季節洄游習性，春季因生殖集群游向近岸產卵場，一般棲息于水深40～100 m泥沙底海區，為捕食性魚類，食性較雜，主要攝食底棲動物及小型魚類［27－28］。中華櫛孔蝦虎魚隸屬鱸形目（Perciformes），蝦虎魚科（Gobiidae），櫛孔蝦虎魚屬，為暖水性近岸底層小型魚類，攝食浮游 生物［29］。龍頭魚隸屬仙女魚目（Aulopiformes），狗母魚科（Synodontidae），龍頭魚屬，為大陸架水域中下層魚類，主要攝食魚類和甲殼類［30］。根據3種魚類遺傳多樣性結構比較分析結果，并比對既往于2007年12月（冬季）和2008年6月（夏季）［2］、2014年11月（秋季）和2015年5月（春季）［4］進行的三門灣漁業資源調查結果，發現與白姑魚、中華櫛孔蝦虎魚相比，龍頭魚作為三門灣主要魚類優勢種的出現頻率更高，推測這是由于相比于其他2種魚類，龍頭魚種群遺傳多樣性相對更豐富。

基于上述分析，本研究中三門灣海域白姑魚、中華櫛孔蝦虎魚和龍頭魚等3種優勢魚種遺傳多樣性水平較低，一旦受環境變化、人類捕撈等干擾，遺傳多樣性可能難以恢復，進一步造成魚類種質資源衰退［6］。因此，未來需重點關注此海域生物群體遺傳多樣性水平較低的現狀，及時加強種質資源的收集、保存，利用簡化基因組或全基因組等多種分析技術進一步揭示基因遺傳信息、生物遺傳背景，分析氣候變化與人類活動對生物的影響，進而制訂更合理的保護與利用策略［6，33］。針對三門灣白姑魚、中華櫛孔蝦虎魚和龍頭魚等魚類優勢種，需注重加強其種質資源保護。

本研究中白姑魚是3種魚類中唯一的洄游性魚類，東海沿海河口、海灣是白姑魚的主要產卵場及索餌場。春季，白姑魚在東海禁漁線以西水域產卵，并逐漸向北移動。夏季洄游至長江口海域和江蘇南部近海。秋季隨著冷空氣南下，魚群開始南下越冬洄游至長江口海域。冬季到達浙江中部和南部近海越冬場［34－35］。因此需要進一步采取措施加強對東海三門灣水域水生生物產卵場、索餌場、越冬場等棲息地的有效保護。海洋漁業資源作為一類再生資源是有條件的，離不開對魚類資源的深入研究了解和科學管理，盡管近年來實施休漁制度和保護措施已取得一定成效，但從調查結果看，為加強生物遺傳多樣性保護，還需要進一步嚴格控制捕撈強度［34，36］，以促進漁業資源可持續利用。

致謝：本研究采樣過程得到自然資源部第二海洋研究所朱根海、劉清河、武芳竹、于翔，浙江省海洋水產養殖研究所彭欣、陳偉峰等老師和同學的幫助，謹致謝忱！