深圳龍華區(qū)孕婦血清維生素D水平及其受體基因rs2228570多態(tài)性與子癇前期易感性相關性研究

崔普芳，劉愛勝，李 喆，張 燕，季新梅，劉國棟

（深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院 a.婦產科；b.檢驗科，廣東深圳 518109）

子癇前期（preeclampsia，PE）是婦女妊娠期內所特有的一種疾病，主要表現為妊娠20 周后出現高血壓、蛋白尿及水腫，是導致孕產婦和圍產兒死亡的主要原因之一[1-3]。PE 發(fā)病病因和機制十分復雜，至今尚未完全闡明。有研究表明，孕婦維生素D（vitamin D，Vit D）缺乏會增加PE 和妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）的發(fā)病風險。Vit D 多種生物學效應主要通過與其受體（vitamin D receptor，VDR）結合才發(fā)揮的，但VDR 基因多個位點存在多態(tài)性，且其多態(tài)性可能會影響Vit D 水平表達或結構，從而導致VDR 基因多態(tài)性與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關[4-6]。近年來，有關VDR 基因多態(tài)性與PE 易感性已見少數報道，但不同地區(qū)和種族人群之間結論不一致[7-9]。為此，本研究對深圳龍華區(qū)孕婦血清中VitD 水平及VDR 基因rs2228570 位點單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）進行了分析，為妊娠期PE 的早期診斷、治療、預防及發(fā)病機制的研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2019年3月～2020年12月在深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院婦產中心就診并確診為PE的孕婦87 例為PE 組，其中輕度PE 48 例，重度PE 39 例。年齡23～49 歲，平均年齡32.56±8.91 歲。孕周20～29 周，平均25.02±3.18 周。選取同期健康孕婦120 例為對照組，年齡22～50 歲，平均年齡33.07±9.78 歲。孕周21～30 周，平均25.73±3.65 周。確保兩組的年齡和孕周等一般性資料差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。納入標準：①符合《妊娠期高血壓疾病診治指南（2015）》中PE 診斷標準[10]；②孕周≥20 周；③有規(guī)律產檢和資料完整者；④單胎者；⑤自愿并積極配合者；⑥患者及家屬知情同意者；⑦經同醫(yī)院倫理委員同意批準。排除標準：①伴有實質器官、免疫及血液等基礎疾病者；②伴有慢性高血壓、心臟病、肝病、腎病及糖尿病者；③多胎者；④甲狀腺功能異常者；⑤有免疫治療史。

1.2 儀器與試劑 c8000 分析儀及試劑（購于美國雅培公司）；1,25-(OH)2Vit D3試劑盒（購于廣州菲康生物技術有限公司）；DNA 提取試劑盒（購于深圳亞能生物技術有限公司）；ABI7500 PCR 基因擴增儀（購于美國ABI 公司）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：于清晨采集空腹靜脈血5～7ml，其中2～3ml 于EDTA-K2抗凝管內，充分混勻，用于VDR 基因rs2228570 位點單核苷酸多態(tài)性分析，剩余的加入無抗凝劑的干燥管內，室溫靜置30min后，分離血清，用于1,25-(OH)2Vit D3水平檢測。

1.3.2 1,25-(OH)2Vit D3水平檢測 ：采用c8000 分析儀對1,25-(OH)2Vit D3水平進行檢測。檢測前對儀器進行保養(yǎng)、校正及質控檢測。所有操作按儀器和試劑盒說明書進行，確保結果的準確性和可比性。

1.3.3 DNA 提取：采用DNA 提取試劑盒提取外周全血DNA，并運用核酸熒光蛋白定量儀對提取的DNA 濃度和純度進行檢測，將A260nm/A280nm 比值為1.7～1.9 的DNA 提取物置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 多態(tài)性分析： 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）法對VDR 基因rs2228570 位點多態(tài)性進行分析，具體操作參照文獻[7,9]。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以百分率（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組1，25-（OH）2Vit D3水平比較 PE 組血清中1，25-（OH）2Vit D3水平（21.67±5.86 nmol/L）明顯低于對照組（37.29±7.65 nmol/L），兩組間差異有統(tǒng)計學意義（t=4.082 5，P=0.032 7）。

2.2 不同程度PE 孕婦1，25-（OH）2Vit D3水平比較重度PE 孕婦1，25-（OH）2Vit D3水平（15.87±3.24 nmol/L）明顯低于輕度PE孕婦（26.95±6.43 nmol/L），兩者差異有統(tǒng)計學意義（t=3.5127，P=0.0352）。經Spearman 相關性分析，PE 組1，25-（OH）2Vit D3水平與PE 病情嚴重程度呈負相關（r= -0.612 4，P=0.05）。

2.3 兩組VDR 基因rs2228570 位點基因型及等位基因頻率比較 見表1。兩組孕婦VDR 基因rs2228570 位點多態(tài)性均檢出TT，CT 和CC 三種基因型，經χ2檢驗，兩組孕婦VDR 基因rs2228570位點基因型和等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（χ2= 1.0893 ，0.851 6；P=0.079 1，0.115 4），具有樣本代表性。PE 組VDR基因rs2228570 位點CC 基因型及C 等位基因頻率明顯高于對照組（65.52% vs 29.17%，77.59% vs 42.50%），兩組間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.280 3，5.102 8，均P<0.05）。CC 基因型和C 等位基因孕婦患PE 的相對風險增加（OR=1.928，95%CI：1.503～2.617 和OR=1.643，95%CI：1.204～1.921），而TT 基因型和T 等位基因孕婦患PE 的相對風險降低（OR=0.529，95%CI：0.326～0.793 和OR=0.671，95%CI：0.485～0.916）。

表1 兩組VDR 基因及不同程度PE VDR 基因rs2228570 位點基因型及等位基因頻率（%）比較

2.4 不同程度PE VDR 基因rs2228570 位點基因型及等位基因頻率比較 見表1。重度PE 組 CC 基因型及C 等位基因頻率高于輕度PE，兩者間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=2.594 3，2.976 0，均P<0.05）。

2.5 PE 組不同基因型1，25-（OH）2Vit D3水平比較 PE 組CC 基因型1，25-（OH）2Vit D3水平（13.78±2.91 nmol/L）明顯低于CT 和CC 基因型孕婦（23.84±6.37 nmol/L 和25.06±6.72 nmol/L），差異有統(tǒng)計學意義（t=3.920 4，4.271 5，P=0.029 6，0.021 7），但CT 和TT 基因型之間差異無統(tǒng)計學意義（t=0.970 3，P=0.152 8）。

3 討論

PE是婦女妊娠期特有的一種常見嚴重并發(fā)癥，其發(fā)病率約為2%～8%，且呈逐年上升趨勢。目前，PE 仍缺乏有效的診斷和治療手段，及早終止妊娠是唯一解決辦法。若診斷和治療不及時，進一步發(fā)展為子癇，孕產婦可能因出現溶血，肝酶升高和血小板減少（hemolysis,elevated liver enzymes,and low platelet count，HELLP）綜合征、胎盤早剝、急性腎衰竭及肺水腫等嚴重并發(fā)癥而死亡，而胎兒輕者可出現生長受限及神經受損，嚴重者會導致死亡，嚴重影響孕婦和胎兒的身心健康和生活質量[11-12]。但PE 病因和發(fā)病機制至今尚未明確，給臨床診斷和治療帶來很大挑戰(zhàn)。因此，探索PE 病因及發(fā)病機制對PE 的診斷、治療及預防具有重要的意義。

Vit D 是一種固醇類衍生物，主要參與體內鈣磷代謝，但最近研究發(fā)現，Vit D 與糖脂代謝、免疫應答及炎癥反應的調節(jié)有關，其含量高低與高血壓、糖尿病及高脂血癥等多種代謝性疾病有密切關系。Vit D 與VDR 結合后可參與胚胎著床、妊娠相關蛋白（pregnancy-associated protein，PAPP）和細胞因子的分泌及鈣的輸送，在維持正常妊娠和胎兒生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[13-14]。有研究表明，約有40%～62%的妊娠期婦女Vit D 水平降低或缺乏，而VitD 水平降低或缺乏可增加PE 的發(fā)病風險[15]。1，25-（OH）2Vit D3是體內Vit D 主要存在形式，其水平高低直接反映Vit D 水平。本研究結果顯示，PE 組1，25-（OH）2Vit D3水平明顯低于對照組，且重度PE 比輕度PE 降低更為明顯（P<0.05）。經Spearman 相關性分析，1，25-（OH）2Vit D3水平與PE 病情嚴重程度呈負相關（r=-0.612 4，P<0.05），與徐曉鋒等[16]報道的基本一致，這表明Vit D 在PE 的發(fā)生和進程中發(fā)揮了重要的作用，這可能與Vit D 水平降低對腎素分泌的抑制作用減弱，導致腎素分泌增加，從而促進血管平滑肌細胞增殖有關[15,17]。

PE 發(fā)病和發(fā)展過程十分復雜，與遺傳、氧化應激、免疫失衡、炎癥反應、胎盤異常及缺血等多種因素有關，但具體病因及發(fā)病機制尚未完全闡明。但有研究表明，PE 發(fā)病是由遺傳和環(huán)境因素共同作用所導致的，其中遺傳因素在PE 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用[7,9]。VDR 基因位于12號染色體長臂1 區(qū)3 帶處，存在多個SNP 位點，極易發(fā)生基因多態(tài)性突變，從而影響VitD 水平或導致其結構異常，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切關系[6,18-19]。有研究表明，VDR 基因rs2228570位點多態(tài)性與妊娠期PE 發(fā)病有一定相關性[7,9]，而REZENDE 等[8]報道兩者之間無相關性，這說明VDR 基因rs2228570 位點多態(tài)性與妊娠期PE 發(fā)病的相關性存在地區(qū)和種族性差異。本研究結果顯示，PE 組和對照組VDR 基因rs2228570 位點基因型和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，表明本研究所選取的樣本具有良好的群體代表性。PE 組VDR 基因rs2228570 位點CC 基因型和C 等位基因頻數比對照組明顯升高，且重癥PE明顯高于輕癥PE（P<0.05），同時攜帶CC 基因型和C 等位基因孕婦患PE 的相對風險明顯增加，與有關報道[7,9]的結論基本一致，這表明VDR 基因rs2228570 位點多態(tài)性可能與深圳地區(qū)妊娠期PE 發(fā)病有一定關系，其中CC 基因型可能是該地區(qū)妊娠期PE 發(fā)病的易感基因之一，這可能與VDR 基因突變后與Vit D結合增加胎盤和子宮內血管壁的炎癥，從而導致孕婦患PE 的相對風險增加有關[20]。此外，結果還顯示，攜帶CC 基因型孕婦血清中1，25-（OH）2Vit D3水平降低比CT 和TT 基因型更為明顯（P<0.05），這說明VDR 基因多態(tài)性突變可能是通過影響1，25-（OH）2Vit D3水平或導致其結構異常而在妊娠期PE 發(fā)病中發(fā)揮重要作用的[21]，具體作用機制有待深入研究。

綜上所述，深圳地區(qū)妊娠期PE 孕婦血清中1，25-（OH）2Vit D3水平明顯降低，且VDR 基因rs2228570 位點多態(tài)性與妊娠期PE 發(fā)病有一定相關性，但存在地區(qū)和種族性差異。因此，加強不同地區(qū)人群Vit D 水平及VDR 基因多態(tài)性監(jiān)測分析，對妊娠期PE 孕婦的早期診斷、治療及預防具有重要的意義。