妊娠期糖尿病患者血清miR-21，PPARγ和IGF-1R表達水平與凝血功能和妊娠結局的相關性研究

孫 紅，付翠芳，高佳麗，霍森燁，王新月，王文麗

（邢臺市第三醫院，河北邢臺 054000）

妊娠期糖尿病（gestationaldiabetes mellitus，GDM）產婦凝血功能紊亂，較正常孕婦存在纖維蛋白溶解活性增強、血小板明顯活化等癥狀，容易導致不良妊娠結局，危及母體、胎兒生命安全，因此盡早評估不良妊娠結局風險至關重要[1-2]。深入研究GDM 患者血清指標以及對妊娠結局的影響在GDM 以及妊娠結局中的作用，可指導醫師提前監測，評估不良妊娠結局風險，從而盡早開展針對性治療，有助于降低母嬰罹患心血管疾病、代謝綜合征的近遠期風險。近年來，越來越多研究發現胰島素抵抗(insulin resistance,IR)與GDM 的發生密切相關，血清中的胰島素樣生長因子1 受體(insulin 1ike growth factor 1 receptor,IGF-1R）水平的增加是妊娠期胰島素抵抗以及GDM 發生的機制之一[3]。micro RNA21[4]能通過調節過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferater-activated receptor γ，PPARγ）水平而調控胰島素抵抗，同時，還能參與脂肪細胞的分化，調節胰島素信號通路，可有效維持良好的母胎運輸，保證妊娠期胎盤正常發育[5-7]。目前，關于妊娠期糖尿病患者血清IGF-1R,miR-21 和PPARγ，IGF-1R 表達水平與凝血功能、妊娠結局的關系尚不明確，因此，本文將通過實例進一步探討，從而為臨床預防、預測不良妊娠結局提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取邢臺市第三醫院婦產科2017年1月～2020年1月期間診治的164 例GDM 患者為GDM 組，以同期健康妊娠產婦100 例為對照組，年齡22～38 歲，孕周24～28 周。納入標準：符合人民衛生出版社出版的《婦產科學(第8 版)》中關于GDM 的診斷標準[8]，即孕24～28 周進行口服葡萄糖耐量試驗，空腹血糖（FPG）≥5.1 mmol/L，或者口服75g 葡萄糖后1h 血糖≥10.0 mmol/L，服糖后2 h 血糖≥8.5 mmol/L。排除標準：有免疫、神經系統疾病者；入組前近3 個月內使用過糖皮質激素者；多胎妊娠患者；嚴重認知功能障礙者；伴隨其他并發癥（冠心病、高血壓等）者。兩組孕婦年齡、BMI，孕周等一般資料比較差異均無統計學意義（均P>0.05）。

1.2 儀器與試劑 邁瑞BS200 型全自動生化分析儀，C3510 血凝分析儀，邁瑞H50 糖化血紅蛋白分析儀，Micro17R 型離心機，Multiskan? FC 酶標儀，Prism 7000 型PCR 儀，酶聯免疫吸附測定試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；人磷酸甘油酸脫氫酶（GADPH）、總RNA 提取試劑盒，PCR 試劑盒購自默克；Sigma-Aldrich，miRNA 逆轉錄試劑盒購于日本Takara 公司；所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 方法 受試者入組后當天下午7 點禁食不禁水，次日清晨空腹采集外周靜脈血2ml×4 管，采用EDTA-K2抗凝，其中第1 管用于檢測血脂、血糖、糖化血紅蛋白（HbAlc）空腹胰島素(fasting insulin,FINS)和穩態模式胰島素抵抗指數(HOMAIR)=FPG×FINS/22.5。

第2 管用于檢查凝血指標，包括凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時間(activation of partial thrombin time,APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)和D-二聚體(D- dimer,D-D)。

第3 管靜置1h 后3 000 r/min 離心20min，取上清保存于-80℃待測。測定血清PPARγ 和IGF-1R 水平，繪制ELISA 標準曲線并根據標準曲線計算血清PPARγ 和IGF-1R 濃度。

第4 管用于檢測miR-21 表達量，參照TRIzol試劑盒說明書使用方法提取外周血中總RNA，使用反轉錄試劑盒將總RNA 進行反轉錄，得到模板單鏈cDNA，隨后使用PCR 試劑盒對cDNA 進行PCR，PCR 反應條件為95 ℃預變性15 s，95℃變性10s，60℃退火300s，72℃延伸30s，連續40 個循環。以GADPH 為內參，根據miR-21 與GADPH的Ct值計算相對表達量，以2－△△Ct表示miR-21相對GADPH 表達量，△△Ct=（Ct目的基因-CtGADPH）-（Ct對照目的基因-Ct對照GADPHU6）。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0 軟件分析所有數據，其中計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗，計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗，相關性分析采用 Pearson 分析以及多元線性回歸分析影響妊娠結局的獨立影響因素。P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血糖指標、血凝指標和micro RNA21,PPARγ，IGF-1R 比較 見表1。GDM 組血糖指標（空腹OGTT,1h OGTT,2h OGTT,HbAlc,HOMAIR）均明顯高于對照組，PT,APTT,micro RNA21和PPARγ 明顯低于對照組，而FIB,D-D 和IGF-1R明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。

表1 兩組血糖指標、血凝指標和Micro RNA21,PPARγ，IGF-1R 比較（±s）

項目GDM 組（n=164）對照組（n=100）tP空腹OGTT(mmol/L) 5.48±0.284.42±0.2431.456<0.001 1h OGTT(mmol/L)9.75±0.375.32±0.31 100.176 <0.001 2h OGTT(mmol/L)8.45±0.424.85±0.3869.999<0.001 HbAlc（%）6.98±0.625.12±0.5324.948<0.001 HOMA-IR3.34±0.382.31±0.2526.546<0.001 PT（s）10.93±1.54 11.74±1.664.024<0.001 APTT（s）26.41±1.84 28.38±1.369.958<0.001 FIB（g/L）4.72±0.563.95±0.5111.204<0.001 D-D（μg/L） 349.43±34.64 308.46±30.42 9.753<0.001 Micro RNA210.88±0.151.76±0.3722.675<0.001 PPARγ（ng/L）0.23±0.041.62±0.2751.140<0.001 IGF-1R（μg/L） 1.43±0.240.75±0.1826.169<0.001

2.2 micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 與凝血功能相關指標的相關性分析 見表2。Pearson 分析micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 與凝血功能相關指標的相關性，結果顯示micro RNA21,PPARγ 與PT,APTT 呈正相關，與 FIB,D-D 呈負相關。IGF-1R 與PT,APTT 呈負相關，與 FIB,D-D 呈正相關，差異均有統計學意義（均P<0.005）。

表2 Micro RNA21,PPARγ,IGF-1R 與凝血功能指標的相關性分析

2.3 兩組受試者不良妊娠結局比較 GDM 組不良妊娠結局主要為前置胎盤（3 例）、產后出血（4 例）、胎兒窘迫（1 例）、畸形（5 例）和早產（12 例）；對照組主要為產后出血（1 例）和早產（4 例），GDM 組不良妊娠結局發生率（15.24%）明顯高于對照組（5.00%），差異有統計學意義（χ2=6.472,P=0.011）。

2.4 不同妊娠結局產婦的micro RNA21,PPARγ和IGF-1R 水平比較 見表3。不良妊娠結局產婦的micro RNA21,PPARγ 水平低于妊娠結局良好產婦，而IGF-1R 水平高于妊娠結局良好產婦,差異均有統計學意義（P<0.05）。

表3 不良妊娠結局產婦的血清Micro RNA21,PPARγ,IGF-1R 水平比較（±s）

表3 不良妊娠結局產婦的血清Micro RNA21,PPARγ,IGF-1R 水平比較（±s）

項 目不良妊娠結局組（n=30）妊娠結局良好組（n=134）tP Micro RNA210.77±0.141.27±0.3514.575 <0.001 PPARγ（ng/L）0.26±0.040.82±0.2630.271 <0.001 IGF-1R（μg/L） 1.86±0.251.29±0.2113.684 <0.001

2.5 多元線性回歸分析 見表4。以妊娠結局作為因變量，以micro RNA21,PPARγ,IGF-1R 作為自變量，采用逐步回歸法進行多元線性回歸分析，所有自變量均取實際值。結果表明：micro RNA21,PPARγ 和IGF-1 均是影響妊娠結局的獨立影響因素（P<0.05）。

表4 多元線性回歸分析

3 討論

GDM 是妊娠期常見的內分泌代謝紊亂疾病，主要表現為葡萄糖耐量異常，臨床不良妊娠結局，如早產、胎兒畸形、胎兒生長受限、胎兒窘迫等不良妊娠結局[9]。目前，普遍認為胰島素抵抗是GDM 的主要病理機制，micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 在胰島素抵抗中發揮重要的調節作用，如噻唑烷二酮類降糖藥物（羅格列酮）通過結合PPARγ 而增加肌肉、肝臟的糖利用以及胰島素的敏感性，從而調節血糖平衡[10]。IGF-1R 是IGFs 中活性最強的受體，其α 亞基與胰島素結合后可導致胞內酪氨酸激酶磷酸化，從而激活PI3K/AKT,Ras/Raf/ERK 等信號通路，是胰島素抵抗、糖尿病等疾病中的重要蛋白[11]。本研究結果顯示，GDM患者的不良妊娠結局發生率明顯高于對照組，進一步分析不同妊娠結局患者的micro RNA21,PPARγ和IGF-1R 表達水平，結果提示不良妊娠結局產婦的micro RNA21,PPARγ水平低于妊娠結局良好產婦，而IGF-1R 水平高于妊娠結局良好產婦，差異具有統計學意義。通過多元線性回歸分析顯示，micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 是影響妊娠結局的獨立影響因素（P<0.05），表明患者血清micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 異常表達均可增加不良妊娠結局風險。分析認為micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R可能通過調節凝血功能從而增加血栓風險，進而影響胚胎正常發育。研究報道認為，IGF-1R 與IGF-1,IGF-2 等特異性結合而促進胎盤生長，調節胎盤功能，影響胎盤的轉運以及代謝功能，若過表達則會促進胎兒的過度生長，容易導致巨大兒，若低水平表達，則影響胎盤的生長發育[12]。PPARγ 參與胎盤發育、胎盤脂肪酸代謝等過程，調節脂肪酸的轉運和儲存，促進人滋養細胞脂肪酸的攝取，參與胎盤滋養細胞的生長、分化以及母胎轉運的建立，維持胎兒生長發育和妊娠。同時，劉嗣超等[13]研究發現GDM 組孕婦胎盤組織中PPARγ，mRNA及蛋白均處于低表達狀態，胰島素抵抗系數明顯升高，表明PPARγ 參與孕期糖代謝以及GDM 的發生發展，且低水平容易導致胎兒發育異常，引起不良妊娠結局。另外，micro RNA21 一方面通過促進PPARγ 基因的表達而降低不良妊娠結局風險，同時還能通過調節脂質代謝而改善患者血凝狀態，利于胎盤氧氣、營養輸送，避免胎兒處于慢性缺氧狀態，保證正常生長發育[7,14]，因此通過監測患者的micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 表達水平，能夠提早預測，盡早給予對癥治療，降低不良妊娠發生率，具有重大的臨床意義。

GDM 可損傷抗凝系統、血管內皮細胞，從而激活血液凝固系統，進一步誘導紅細胞及血小板凝集，加重高凝狀態，增加血栓風險[15]，因此及早評估凝血功能狀態，能夠降低妊娠風險。本次研究結果顯示micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 在GDM 患者血清中表達異常，且Pearson 分析顯示micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 與凝血功能相關指標（PT,APTT,FIB,D-D）水平具有相關性（均P<0.005），原因推測為Micro RNA21 是一種由20 ～25 個核苷酸組成的非編碼RNA，可調控血管發育，促進血管損傷修復，同時還能通過抑制三羥基三甲基輔酶A 還原酶而調控三酰甘油和膽固醇的代謝，從而改善血液高凝狀態[16]，故而micro RNA21 水平與FIB,D-D 呈負相關性。趙曉云等[7]研究發現，在非酒精性脂肪肝病的肝組織中micro RNA21 還能調節PPAR-α 和PPAR-γ 的基因表達，從而調節脂質分解代謝以及糖代謝，改善胰島素抵抗。PPAR-γ 能調節胎盤組織Visfatin 基因的表達，增加脂肪細胞和骨骼肌細胞攝取葡萄糖，以及抑制肝糖原的釋放，降低血糖，改善高凝狀態[18]。動物模型研究顯示，使用PPAR-γ 激動劑可增加胰島素敏感性，減少胰島素抵抗，在血壓、葡萄糖、脂質的穩態發揮重要作用，從而降低對凝血系統的刺激，減少FIB,D-D 等促凝因子的釋放[18]。所以micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 均可能調節凝血功能，從而參與GDM 的發生、發展。

綜上所述，micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 在妊娠期糖尿病患者血清中表達異常，與凝血功能呈相關性，是影響妊娠結局的危險因素，監測其趨勢，可以為臨床醫師提供預警信號，降低不良妊娠風險。隨著孕期的變化，產婦血清凝血功能指標均處于動態變化中，而本次研究并未連續監測不同孕周產婦的血清micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 水平，因此之后需深入研究各血清指標隨著孕周的變化趨勢，以及與凝血指標間的動態相關性，從而指導醫師及時評估各孕周階段患者的不良妊娠結局風險。