非洲豬瘟病毒CD2v抗體間接ELISA方法的建立及其初步應用

凌占業(yè)，徐 倩，楊洪雨

(河南省黃泛區(qū)鑫欣牧業(yè)股份有限公司，河南 周口 466632)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，發(fā)病患畜多表現(xiàn)為高熱、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官明顯出血、呼吸障礙及神經(jīng)癥狀等，強毒株感染后發(fā)病率和死亡率最高可達100%，對養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。1921年，英國獸醫(yī)學家Montgomery等首次報道肯尼亞的ASF疫情[1-2]；2007年，ASF疫情在高加索地區(qū)的格魯吉亞出現(xiàn)，隨后迅速蔓延至俄羅斯聯(lián)邦以及東歐等周邊國家[3-4]；2018年8月1日我國遼寧省沈陽市沈北地區(qū)發(fā)現(xiàn)了ASF疫情，經(jīng)B646L/p72基因進化樹分析發(fā)現(xiàn)該病毒屬于基因Ⅱ型，與俄羅斯和東歐流行的Georgia 2007/1毒株屬于一個進化分支[5]，目前我國多處如江蘇、安徽、河南及內(nèi)蒙古等已發(fā)現(xiàn)ASF疫情。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。

ASFV是一種有囊膜的單分子雙鏈DNA病毒，大小約為170～190 kb，在其基因組結(jié)構(gòu)中，中間125 kb為保守序列，兩端為可變區(qū)，基因組含有151～167個開放閱讀框(ORFs)，編碼150～200種蛋白質(zhì)[6-10]，其中存在許多與病毒復制、免疫逃逸、病毒傳播等相關的蛋白。ASFV EP402R基因全長為1 083 bp，編碼的蛋白大小為41 ku，是嵌入病毒囊膜外表面的膜蛋白，類似于T淋巴細胞表面的黏附受體CD2，所以命名為CD2v[11]。它由信號肽、跨膜域及147個氨基酸的胞質(zhì)尾組成，是ASFV晚期表達蛋白，可以導致紅細胞吸附于病毒感染細胞表面，有助于其在宿主體內(nèi)擴散[12]；該蛋白具有抑制有絲分裂原刺激淋巴細胞增殖的作用，具體機制可能是通過CD2v細胞外結(jié)構(gòu)域與淋巴細胞表面配體的直接相互作用，或通過CD2v細胞質(zhì)中結(jié)構(gòu)域與胞質(zhì)蛋白相互作用而介導[13]。本試驗以真核表達的ASFV CD2v蛋白為包被抗原，建立了檢測ASFV抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)血清學診斷方法，該方法具有良好的特異性和敏感性，可以用于ASFV抗體檢測，以期為CD2v蛋白的生物學功能研究、ASFV血清學診斷試劑的制備及疫苗開發(fā)奠定基礎，同時對預防外來ASF傳入我國提供了檢測方法的技術儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2020年10—12月在某公司動物疫病監(jiān)測中心進行。

1.2 材料

1.2.1 試劑 非洲豬瘟病毒(CD2v)抗體ELISA檢測試劑盒購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司；兔抗豬IgG-HRP(1∶500～1∶5 000)、TMB單組分顯色液均購自索萊寶生物科技有限公司；明膠封閉緩沖液購自生工生物工程(上海)股份有限公司；PBS磷酸緩沖液、Albumin Bovine、ELISA酶標板購自鄭州科邦生物科技有限公司；其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2.2 CD2v蛋白 試驗用包被抗原由中國農(nóng)業(yè)科學院提供。

1.2.3 血清 ASFV感染血清10份[由哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司的非洲豬瘟病毒(CD2v)抗體ELISA檢測試劑盒檢測抗體為陽性]由國家非洲豬瘟參考實驗室提供；偽狂犬病病毒(PRV-gE)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒O型(FMDV-O)、口蹄疫病毒A型(FMDV-A)陽性血清各3份，健康豬血清40份由中牧實業(yè)股份有限公司提供。

1.2.4 試驗儀器 生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；振蕩器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)；全自動酶標洗板機(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司)；4 ℃冰箱(青島海爾股份有限公司)；手提式壓力蒸汽滅菌器(寧波凌宏醫(yī)療器械科技有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)。

1.3 間接ELISA方法的建立及反應條件的優(yōu)化

1.3.1 最佳包被濃度和血清稀釋倍數(shù)的確定 采用方陣滴定試驗確定最佳反應條件，將純化后的重組蛋白分別稀釋至20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、2 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL，加入96孔酶標板，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h轉(zhuǎn)入4 ℃包被過夜，次日用PBST洗滌5次；隨后1% BSA磷酸緩沖液封閉1.5 h(200 μL/孔)，用PBST洗滌5次；ASFV陽性血清和陰性血清分別按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200稀釋，100 μL/孔進行方陣試驗，37 ℃下孵育45 min，用PBST洗滌5次；將兔抗豬IgG-HRP二抗稀釋至1∶4 000后加入孔中，100 μL/孔，37 ℃作用0.5 h，用PBST洗滌5次；加入TMB避光顯色(100 μL/孔)，37 ℃孵育10 min；加入2 mol/L H2SO4終止顯色(50 μL/孔)，比較各孔OD450nm值，挑選接近1.0的陽性值，并根據(jù)P/N值篩選出最佳抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)。

1.3.2 封閉液的篩選 用最佳濃度抗原包被96孔酶標板，分別用含5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液、1% BSA磷酸鹽緩沖液及含明膠的磷酸鹽緩沖液，200 μL/孔，37 ℃下孵育1.5 h，按上述間接ELISA反應測定，篩選出最佳封閉時間。

1.3.3 血清最佳反應時間篩選試驗 用最佳濃度抗原包被96孔酶標板，血清孵育時間分別為1.5 h、1 h、45 min、30 min，酶標二抗的孵育時間30 min，37 ℃孵育(100 μL/孔)，按上述間接ELISA反應測定，篩選出最佳孵育時間。

1.3.4 酶標抗體工作濃度與顯色時間的確定 將兔抗豬IgG-HRP二抗分別按照1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶5 000用PBST、5%脫脂奶粉、1% BSA及明膠封閉緩沖液進行稀釋，其余按上述間接ELISA反應測定，篩選出最佳酶標抗體工作濃度；加入TMB后，分別顯色3 min、5 min、10 min，讀取OD450nm值，選取P/N值較大的顯色時間作為底物顯色時間。

1.3.5 穩(wěn)定性檢測 選取非洲豬瘟陽性及陰性共6份豬血清樣品，用3批包被的酶標板檢測，在同一塊酶標板上進行批內(nèi)重復，不同酶標板之間進行批間重復，每個樣品重復檢測3次，計算標準偏差及變異系數(shù)。

1.3.6 陰陽性判定閾值與檢測限的判定 用上述優(yōu)化的間接ELISA方法檢測50份ASFV陰性血清，在樣品符合正態(tài)分布的條件下，根據(jù)測得的OD450nm值，計算平均值和3倍標準差之和，將平均值和3倍標準差作為陰、陽性的判定標準，大于該臨界值判定為陽性Positive Cut off(PC)=X＋3SD，小于該臨界值判定為陰性Negative Cut off(NC)=X＋3SD，介于二者之間的判為可疑。

1.3.7 特異性試驗 用建立的間接ELISA檢測方法對偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、口蹄疫病毒O型與A型及非洲豬瘟陽性血清進行檢測，每種血清各取3份，并設置ASFV陽性血清與陰性血清作為對照，從而評估本研究建立的ELISA方法的特異性。

1.3.8 靈敏度試驗 將非洲豬瘟陽性血清1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400稀釋，采用優(yōu)化的間接ELISA方法，檢測不同稀釋倍數(shù)的陽性血清，根據(jù)檢測結(jié)果判定陽性血清最大稀釋倍數(shù)，以評價所建ELISA方法的靈敏度。

1.3.9 間接ELISA抗體檢測方法的臨床應用(符合率試驗) 采集河南部分地區(qū)豬血清50份，利用建立的ASFV CD2v間接ELISA方法和哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司非洲豬瘟病毒(CD2v)抗體ELISA檢測試劑盒對10份ASFV感染豬血清和40份健康豬血清進行檢測，對比兩種方法檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 抗原包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定結(jié)果

由表1可知，抗原包被濃度為10 μg/mL、血清稀釋倍數(shù)為1∶25時，此時P/N值最大，因此抗原的最佳包被濃度為10 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶25。

表1 方陣滴定結(jié)果(P/N值)

2.2 封閉液的選擇

由圖1可知，以1% BSA(牛血清白蛋白)與明膠封閉緩沖液進行封閉，陽性血清OD450nm值/陰性血清OD450nm值(P/N)最大，因此確定1% BSA與明膠封閉緩沖液為最佳封閉液。

圖1 最佳封閉液的篩選

2.3 血清最佳反應時間的篩選

由圖2可知，待檢的陰陽血清孵育60 min后，抗原與抗體結(jié)合比較充分，P/N值最大，所以選擇60 min作為待檢血清的最佳反應時間。

圖2 血清最佳反應時間的篩選

2.4 酶標抗體工作濃度的確定

由圖3可知，酶標抗體分別按照1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶5 000稀釋時，根據(jù)P/N值大小確定二抗的最佳稀釋比例，其中稀釋到1∶2 000時，P/N值最大，因此酶標抗體的最佳工作濃度為1∶2 000。

圖3 酶標抗體最佳工作濃度的確定

2.5 酶標抗體最佳稀釋液的確定

由圖4可知，用PBST以1∶2 000稀釋二抗時，根據(jù)P/N值大小確定最適稀釋液，當稀釋液為PBST時，P/N值最大，因此酶標抗體的最佳稀釋液為PBST。

圖4 酶標抗體最佳稀釋液的確定

2.6 TMB最佳顯色時間的確定

由圖5可知，根據(jù)上述試驗優(yōu)化好的條件，加入TMB后分別顯色3 min、5 min、10 min，根據(jù)P/N值大小確定顯色時間。TMB孵育10 min后，P/N值最大，故選擇10 min作為TMB顯色底物的孵育時間。

圖5 TMB最佳顯色時間的確定

2.7 重復性試驗

由表2可知，用同一批次包被的酶標板檢測6份血清，每份血清3個重復，結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)均＜10%，說明所建ELISA方法具有較好的批內(nèi)重復性；用3個不同批次的酶標板檢測6份血清，結(jié)果顯示批間變異系數(shù)均＜10%，3份陽性血清檢測均值的批間變異系數(shù)均大于批內(nèi)變異系數(shù)，同時3份陰性血清中僅有1份檢測均值的批間變異系數(shù)小于批內(nèi)變異系數(shù)，故說明所建的ELISA方法批間重復性稍差于批內(nèi)重復。

表2 穩(wěn)定性結(jié)果

2.8 臨界值的確定

由表3可知，將確定為ASFV陰性的50份血清進行ELISA檢測，得出樣本平均OD450nm值為0.228，標準差為0.046，將(平均值＋3倍標準差)作為陰、陽性的判定標準，結(jié)果可知，陽性臨界值為0.366，當待檢樣品大于該臨界值判定為陽性，小于0.32判定為陰性，介于二者之間則判定為可疑。

表3 陰陽性判定閾值的確定

2.9 特異性試驗

用建立的ELISA方法對PRV-gE、CSFV、PRRSV、FMDV-O、FMDV-A進行檢測，結(jié)果顯示，5種病毒陽性血清的OD450nm值均＜0.366，均為陰性(圖6)，表明該方法具有良好的特異性。

圖6 特異性試驗結(jié)果

2.10 靈敏度試驗

用建立的ELISA方法對倍比稀釋的ASFV陽性血清進行檢測，結(jié)果顯示，當陽性血清稀釋50倍時，OD450nm值仍大于0.366(圖7)，說明所建ELISA方法具有較好的靈敏度。

圖7 敏感性試驗結(jié)果

2.11 符合率試驗

對50份血清(10份ASFV感染豬血清和40份健康豬血清)進行檢測，結(jié)果顯示，本研究建立的非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測方法(iELISA)和哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司非洲豬瘟病毒(CD2v)抗體ELISA檢測試劑盒共有46份血清檢測結(jié)果一致，符合率為92%(表4)。

表4 不同檢測方法符合率的評價 份

3 討論

ASF作為一類動物傳染病，自暴發(fā)后對中國養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的打擊，雖然很多學者一直致力于該疫苗的研發(fā)，但目前為止仍無有效的商品化疫苗用于該病的預防。疫情發(fā)生后主要采取撲殺和凈化等措施，且防控多集中在加強基礎飼養(yǎng)管理、構(gòu)建生物安全體系、及時檢疫等，因此建立一種ASFV快速高效的檢疫方法尤為重要。

EP402R基因是ASFV參與免疫逃避的關鍵基因之一。有研究表明，敲除MaLawi Li1-20/1毒株的EP402R基因延遲了病毒血癥及病毒的傳播；基因Ⅰ型分離株BAV71病毒株中敲除該基因，導致病毒毒力減弱并誘導對強毒攻擊的完全保護[14-17]。目前國內(nèi)研究較多的是MGF360/505R家族和CD2v雙基因缺失株[11,17-21]，結(jié)果表明，基因Ⅱ國內(nèi)分離株EP402R(CD2v)基因單獨缺失對病毒毒力影響有限，而MGF基因(含3個MGF505基因和3個MGF360基因)缺失后，高劑量引起家豬發(fā)燒，低劑量則無此表現(xiàn)。在MGF缺失的基礎上進一步缺失EP402R基因后，MGF缺失株的毒力也隨之下降，但該候選疫苗的長期安全性還有待考證[22]。所以，建立ASFV CD2v抗體間接ELISA檢測方法在一定程度上可以推動ASFV雙基因缺失苗的研發(fā)。

本研究選擇了ASFV的CD2v蛋白進行了真核表達，基于真核表達系統(tǒng)在蛋白翻譯后修飾方面的較原核表達系統(tǒng)存在的優(yōu)勢，即具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工，如二硫鍵的形成、糖基化、磷酸化和正確折疊等，使表達蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上能夠接近于天然蛋白，抗原表位能夠最大限度的保留，重組表達則為可溶性表達。但真核表達系統(tǒng)也存在一定的缺陷，表達量偏低，通過常規(guī)純化技術很難獲得靶蛋白。

以該純化的蛋白為包被抗原建立檢測ASFV血清抗體的間接ELISA方法，由于附著在酶標板底部的重組蛋白在空間構(gòu)象、存在形式、分布和排列方式等方面與侵入機體引起免疫應答的病毒并不完全吻合，所以在進行實際樣品檢測時會有假陽性結(jié)果，即檢測的敏感性降低，而造成這一結(jié)果的主要原因可能與抗原抗體的特異性結(jié)合有關，即抗原的特異性取決于抗原分子中的抗原決定簇，其只能與所感染病毒產(chǎn)生的特異性抗體結(jié)合。另外，本試驗通過驗證該方法的靈敏性發(fā)現(xiàn)，不同批次的包被抗原其純化效果可能不同，若雜蛋白含量較多，血清中的成分與雜蛋白非特異性結(jié)合易造成檢測限降低，出現(xiàn)假陽性。此外，試驗對待檢血清要求比較高，應避免樣品因采集、貯存或處理不當?shù)纫蛩囟斐傻臉悠肺廴尽⑷苎悠纺蝗龋驗橐坏┎僮鞑划敇O有可能影響試驗結(jié)果或污染實驗室存在散毒的風險。

同時，本試驗對酶標二抗的工作濃度與稀釋液以及TMB(四甲基聯(lián)苯胺)顯色時間進行了篩選比較后發(fā)現(xiàn)，不同的封閉試劑其濃度和類型也會增加非特異性背景，有時BSA的封閉效果優(yōu)于脫脂奶粉，但有些抗體在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景。另外，若酶標二抗的使用比例過高，極易造成背景值偏高，導致非特異性顯色。同等條件下，酶標二抗的稀釋液不同，所測得的OD值也會存在差異。因此，本試驗最終選取1%BSA與明膠封閉緩沖液進行封閉，以PBST作為稀釋液(符合兔抗豬IgG-HRP要求)，1∶2 000作為酶標二抗的工作濃度繼續(xù)進行后續(xù)試驗。

4 結(jié)論

本試驗通過對已知背景的血清進行檢測，驗證了基于CD2v蛋白建立的間接ELISA方法的穩(wěn)定性、靈敏性、特異性及與元亨試劑盒之間的符合率，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定、可靠，為下一步研制ASFV的間接ELISA試劑盒提供參考依據(jù)，也為控制ASFV的傳播提供技術儲備。雖然該方法可以很好地檢測出標準陽性血清樣品，但對其他臨床血清樣品檢測效果如何，還需進一步求證，通過大量檢測不同的血清樣品，積累試驗數(shù)據(jù)，完善檢測方法。目前關于非洲豬瘟基因缺失苗研究的較少，其原因在于ASFV自身結(jié)構(gòu)復雜，病毒感染和免疫機制并不十分明確，而且ASFV產(chǎn)生的中和抗體不具有中和活性。所以后續(xù)若有ASF基因缺失苗應用于市場，而我們所建立的方法則對ASF疫苗免疫后的抗體水平有一定的監(jiān)測作用。