新疆部分地區(qū)豬口蹄疫病毒O型抗體檢測與分析

常軍帥，李 娜，王紫陽，屈勇剛，梁 晏，趙 玉，陳 寧

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.動物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003)

口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease virus, FMDV)引起的一種人獸共患烈性傳染病。最早發(fā)生于1954年的意大利，隨后在美國、墨西哥、加拿大及我國相繼出現(xiàn)大規(guī)模暴發(fā)[1]。該病主要感染豬、牛、羊等偶蹄類動物，羊感染后不表現(xiàn)臨床癥狀，但可長期向外排毒，病畜和隱性感染動物是FMDV的主要傳染源。FMDV感染豬3 d后即可表現(xiàn)出臨床癥狀，癥狀與豬痘、豬水皰病、滲出性皮炎相似，表現(xiàn)為口腔、蹄部、乳腺等地方出現(xiàn)水皰，體溫升高至41 ℃，水皰破裂后開始糜爛，易繼發(fā)細(xì)菌感染；嚴(yán)重病例可見成年豬蹄匣脫落，病豬臥地不愿行走。仔豬感染后表現(xiàn)為心肌炎，剖檢可見“虎斑心”，少數(shù)病例表現(xiàn)為腸胃出血。FMDV包括7個血清型(A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型)，在我國以O(shè)型為主，A型時有發(fā)生。FMDV的傳播方式分為彌漫擴(kuò)散式和跳躍式兩種，后者主要表現(xiàn)為FMDV可隨風(fēng)傳播到60 km外的地方，通過空氣感染健康豬群，為防治FMD增加了難度。正是由于FMDV對仔豬造成的死亡率高、增加了成年豬的料重比和傳播迅速、無特效藥治療等特點(diǎn)，被動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties, OIE)在《國際動物衛(wèi)生法典》中列為必須上報(bào)的疾病，在我國稱FMD為動物傳染病之首，《家畜家禽防疫條例實(shí)施細(xì)則》中也明確規(guī)定其為一類傳染病[2-3]。為了減少FMDV對我國肉類品牌出口的影響，2012年我國國務(wù)院辦公廳印發(fā)了《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》，控制策略獲得OIE認(rèn)可[4]。

為減少FMDV對我國養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)影響，我國也在不斷研發(fā)免疫效果和安全性能更好的疫苗，現(xiàn)在主要使用的為FMDV-O型滅活疫苗。疫苗質(zhì)量、免疫程序、保存方式、給藥途徑及免疫抑制疾病等都可對免疫效果產(chǎn)生不良影響。ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))檢測在評估豬FMDV疫苗免疫效果、調(diào)整免疫程序時價格低廉、方便快捷。本試驗(yàn)對2019—2020年采集的414份豬血清進(jìn)行FMDV-O型抗體檢測，根據(jù)結(jié)果對各豬場、各豬群進(jìn)行免疫程序優(yōu)化，以減少相關(guān)疾病的發(fā)生。

1 材料

1.1 樣品

2019年1月至2020年12月期間從新疆石河子市、伊犁哈薩克自治州、阿克蘇市、巴音郭楞蒙古自治州、奎屯市、塔城地區(qū)，按照地區(qū)、豬場及豬群類別的不同隨機(jī)采集了414份血樣，分離血清后立即在石河子大學(xué)動物科技學(xué)院進(jìn)行檢測。其中哺乳仔豬60份、保育豬76份、肥育豬45份、后備豬80份、繁殖母豬128份、種公豬25份。

1.2 材料和儀器

口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱購自上海東麓儀器設(shè)備有限公司；獸用一次性采血器5 mL為南昌市山力畜牧器械有限公司產(chǎn)品；移液器購自Eppendorf有限公司；自動酶標(biāo)儀購自北京佳源興業(yè)科技有限公司。

2 方法

2.1 樣品及試劑準(zhǔn)備

新鮮的、冷藏(2～8 ℃少于8 d)的、冰凍的血清都可用于檢測；所有試劑需恢復(fù)至20 ℃，輕微震蕩混勻。25倍PBST用蒸餾水稀釋至1倍PBST；口蹄疫O型病毒抗原使用1倍PBST進(jìn)行40倍稀釋。

2.2 ELISA檢測方法

用PBST稀釋樣品血清至1∶32和1∶64，陽性對照依次稀釋至1∶2 048，陰性至1∶4稀釋；取各孔50 μL稀釋好的樣品轉(zhuǎn)至U型反應(yīng)板上，每孔加入50 μL稀釋好的病毒抗原，再設(shè)置4個100 μL的病毒抗原對照。封板后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)放置1.5 h；各孔吸50 μL轉(zhuǎn)至口蹄疫O型兔抗的ELISA板上，37 ℃孵育1 h；經(jīng)PBST洗5次拍干后，每孔加入50 μL口蹄疫O型豚鼠抗體工作液，封板后37 ℃溫育30 min；再次洗滌，將TMB底物A和B以1∶1的比例混勻后，每孔加50 μL混合物，置于37 ℃顯色15 min；加入50 μL終止液(1.25 mol/L硫酸)，立即測定OD450nm抗體數(shù)值。

2.3 認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)

病毒抗原OD450nm應(yīng)大于1.0，陽性對照效價應(yīng)在(1∶1 024±1)滴度以內(nèi)，陰性對照效價應(yīng)＜1∶8。病毒抗原平均OD值50%計(jì)算(臨界值)方式為：4個病毒抗原OD值中分別去除最高值和最低值，剩余數(shù)值之和除以4，即為臨界值。

2.4 結(jié)果判定

樣品抗體效價大于臨界值判為陰性；小于或等于臨界值判為陽性。

2.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算各組數(shù)據(jù)的結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 臨界值計(jì)算結(jié)果

通過進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算3次臨界值(有效數(shù)據(jù)之和/4)平均數(shù)，結(jié)果為1.00。結(jié)果見表1。

表1 臨界值計(jì)算結(jié)果

3.2 不同豬場FMDV-O型抗體檢測結(jié)果

在414份樣品中，81.88%(339/414)的血清有FMDV-O型的抗體存在，平均OD值為0.54。A～G豬場的陽性率分別為83.87%(52/62)、89.29%(50/56)、95.31%(61/64)、73.96%(71/96)、87.50%(42/48)、75.00%(36/48)、67.50%(27/40)；其中A場的平均OD值最高，為0.74，C場的平均OD值最低，為0.35；C豬場的平均OD值與A、D、F、G存在顯著差異(P＜0.05)；B豬場的平均OD值與C、D、E、F、G場差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)果見表2。

表2 不同豬場FMDV-O抗體檢測結(jié)果

3.3 不同類別豬群FMDV-O型抗體檢測結(jié)果

各類別豬群中，哺乳仔豬、保育豬、肥育豬、后備豬、繁殖母豬、種公豬陽性率分別為76.67%(46/60)、64.47%(49/76)、77.78%(35/45)、85.00%(68/80)、92.19%(118/128)、92.00%(23/25)；其中保育豬的平均OD值最高，為0.79，繁殖母豬的平均OD值最低，為0.34；種公豬的平均OD值與哺乳仔豬、保育豬存在顯著差異(P＜0.05)；肥育豬的平均OD值與后備豬、繁殖母豬差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果見表3。

表3 不同類別豬群FMDV-O型抗體檢測結(jié)果

4 討論與分析

FMD在我國不能徹底凈化的原因主要有兩個：一是極低量的FMDV(50萬倍稀釋后的水皰液1 mL的量)[1]便可導(dǎo)致健康豬發(fā)病，因此豬場只要有隱性感染和患病豬只的存在，就會威脅到整個場區(qū)的安全；二是該病毒可通過空氣傳播，并且豬場周圍60 km內(nèi)有豬、牛、羊等偶蹄類動物患病，就可隨風(fēng)傳播，感染健康豬群。因此，定期評價疫苗免疫效果，才能更好保證種豬場健康生產(chǎn)。

檢測結(jié)果得出，在414份樣品中，81.88%(339/414)的血清有FMDV-O型的抗體存在，明顯高于國家規(guī)定的70%，證明各地區(qū)對FMDV-O型的免疫效果良好[6]；席銳[7]曾于2011—2013年對新疆奇臺縣進(jìn)行過FMDV-O型的抗體檢測，合格率只有36.22%，與本次檢測結(jié)果相差過大，推測其合格率低的原因?yàn)樯B(yǎng)戶免疫意識較差、技術(shù)落后等；史洪巖等[8]得出，北京密云地區(qū)規(guī)模化豬場豬FMDV-O型抗體陽性率為85.48%(265/310)，高于本次檢測結(jié)果，但相差不大，說明目前我國各地對FMDV-O型免疫工作較以前更加重視。G豬場的陽性率只有67.50%(27/40)，低于國家標(biāo)準(zhǔn)，需加強(qiáng)免疫。各類別豬群中，繁殖母豬、種公豬陽性率較高，分別為92.19%(118/128)、92.00%(23/25)。FMDV-O型可存在精液、乳汁中，種豬群是豬場持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)，因此種豬群的免疫工作為重中之重[9]；保育豬的陽性率只有64.47%(49/76)，推測可能由于斷奶造成的應(yīng)激，導(dǎo)致免疫效果變差，可通過調(diào)整免疫時間，減少斷奶應(yīng)激、在飼糧中添加維生素C等方法進(jìn)行改善。種公豬、后備豬、繁殖母豬的平均OD值與哺乳仔豬、保育豬存在顯著差異(P＜0.05)，可針對后備豬進(jìn)行加強(qiáng)免疫，為后備豬下一步的繁殖工作增強(qiáng)保障。

除疫苗防控外，在FMDV的預(yù)防工作中減少引種、定期消毒、科學(xué)飼養(yǎng)等工作也必不可少。不從疫區(qū)引種，引進(jìn)種豬需隔離并進(jìn)行3次FMDV抗原檢測合格后才可合群；定期更換消毒劑，針對豬舍、飲水、人員、飼料、用具等嚴(yán)格消毒；使用全價料，注意微量元素的含量，減少豬群應(yīng)激。只有全方位防控FMDV，才能保證人類健康和國際貿(mào)易的順利進(jìn)行。