FQ-PCR方法檢測腹瀉仔豬腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌試驗

趙 娟，王志宇，段昌學，王志俊，劉一飛，趙 敏，韓潔茹，李正莉

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西 太原 030032；2.陜西省商洛市動物疫病預防控制中心，陜西 商洛 726000)

腸道菌群種類繁多，菌群計量及檢測有較大困難，國內(nèi)外學者已建立了許多診斷方法，如細菌分離鑒定、凝集試驗、瓊脂擴散試驗、熒光抗體技術、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)試劑盒等，但這些方法均費時費力，而且靈敏性均不理想，不適用于常規(guī)的臨床診斷，更不適用于集約化生產(chǎn)中細菌檢測的需要。隨著分子生物學檢測技術的快速發(fā)展，以及聚合酶鏈反應技術的廣泛應用，特別是16S rRNA被廣泛應用于細菌的鑒定，分子生物學檢測方法PCR用于Lactobacillus和Bifidobakterien定量的檢測具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點，但假陽性較多，缺乏準確定量等缺點限制了PCR在實際臨床中的應用[1]。近年來，F(xiàn)QPCR技術以其特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性強等優(yōu)點在微生物的定性和定量檢測等方面得到廣泛應用。本研究建立了快速檢測Lactobacillus和Bifidobakterien的FQ-PCR方法，不僅保留了PCR的優(yōu)點，而且克服了普通PCR的不足，為動物腸道微生態(tài)的測定建立了一種更為有效的方法[2]。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

微量移液器(Eppenderf公司，10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL型)，PCR儀(QIAGEN，Rotor-Gene Q型)，高速低溫離心機(Sigma，2-16PK型)，電子天平(METTLER TOLEDO，AL104-IC型)，高速離心機(Eppendorf，1-14型)，摩爾基因型超純水機(上海摩勒生物科技有限公司，MO6-063型)，立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠，YXQ-LS-SⅡ型)，電熱恒溫鼓風干燥箱(上海聯(lián)進醫(yī)療器械廠，101-2-BS-Ⅱ型)，超低溫冰箱(中科美菱公司)。

1.2 主要試劑和材料

QIAamp DNA Stool Mini Kit購自Qiagen公司；TransStart?Probe qPCR SuperMix購自Qiagen公司；酒精為國產(chǎn)試劑。

1.5 mL進口薄壁離心管購自Corning公司；0.2 mL進口薄壁離心管購自Corning公司；0.2 mL平蓋八排管購自Axygen公司；5 mL有蓋離心管為國產(chǎn)；1 mL、200 μL、10 μL吸頭均為國產(chǎn)；一次性使用棉簽、手套、口罩為國產(chǎn)。試驗材料(腹瀉仔豬和健康仔豬的糞便樣本)來源于山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所豬場及山西省天祿豐種豬場。

2 試驗步驟

2.1 設計qPCR引物[3]

引物序列見表1。

表1 引物序列

2.2 采集糞便樣品

2020年9月23日至10月23日，在天氣溫度驟降仔豬腹瀉高發(fā)期或仔豬腹瀉發(fā)病集中期，項目組在太原市小店區(qū)南郊繁峙鎮(zhèn)的宏利豬場、山西省運城市夏縣眾旺養(yǎng)殖專業(yè)合作社、夏縣宏偉農(nóng)牧有限公司、夏縣健源養(yǎng)殖專業(yè)合作社、夏縣嘉博養(yǎng)殖有限公司等多地采取典型病例糞便作為試驗樣本。用棉簽將健康仔豬和腹瀉仔豬糞便采集入已消毒的5 mL離心管內(nèi)，封蓋。每份樣品貼標簽，詳細注明日期、組織來源、編號。注意樣品一定為新鮮糞便。采集到的樣本帶回實驗室-80 ℃保存。分3批次采集樣本，每批次采集健康仔豬糞便和腹瀉仔豬糞便各20份。

2.3 糞便中總DNA提取

1)稱取180～220 mg糞便加入預冷的2 mL離心管中；2)每管加入1.4 mL的緩沖液ALS(試劑)，渦旋使其完全混勻；3)370 ℃孵育5 min，使其完全裂解；4)渦旋混勻15 s，14 000 r/min離心1 min；5)取1.2 mL的上清液至新的2 mL離心管中，棄沉淀；6)每管加入一片InhibitEX Tablet，立即渦旋直至完全混勻，室溫孵育1 min；7)14 000 r/min離心3 min；8)取全部上清液至新的1.5 mL離心管中，棄沉淀，14 000 r/min離心3 min；9)取新的1.5 mL離心管，每管提前加入15 μL蛋白酶K；10)從第8步中移200 μL上清液至新的1.5 mL離心(已加蛋白酶K)管中；11)加入200 μL的緩沖液，渦旋混勻15 s；12)70 ℃孵育10 min；13)加入200 μL的無水乙醇，完全混勻；14)將全部的上清加入QIAamp spin column柱中，14 000 r/min離心1 min，棄收集管廢液，將柱子重新放入新的收集管中；15)加入500 μL的AW1緩沖液，14 000 r/min離心1 min，將柱子移至新的2 mL收集管中；16)加入500 μL的AW2緩沖液，14 000 r/min離心3 min，棄收集管廢液，將柱子重新放入新的收集管中；17)將柱子放入新的1.5 mL離心管中，14 000 r/min離心1 min；18)將柱子放入新的1.5 mL離心管中，加入200 μL的緩沖液AE，14 000 r/min離心1 min；19)將提取好的DNA做標記，-80 ℃長期保存。

2.4 熒光定量PCR

2.4.1 將DNA從-20 ℃冰箱拿出后置于冰上解凍。

2.4.2 按照以下反應體系配置反應體系于平蓋八排管中(表2)。

表2 熒光定量PCR反應體系

2.4.3 將八排管的管蓋輕輕蓋到八排管上；將八排管放入熒光定量PCR儀中進行反應并設置參數(shù)，PCR反應程序如下(表3)。

表3 熒光定量PCR反應程序

2.4.4 待PCR結(jié)束后，按照Ct值計算檢測基因的表達情況[4]。

3 試驗結(jié)果

(1)糞便中所提取全DNA濃度及純度見表4。

表4 第1～3批次樣本中提取的全DNA濃度及純度

(2)CT值大，說明拷貝數(shù)小，樣本本身mRNA的數(shù)量少。從圖1、圖2中可以看出，健康組和腹瀉組相比，腹瀉組的CT值大，說明其樣本本身所含的mRNA的量少，即：相對比健康仔豬來說，腹瀉仔豬中乳酸桿菌和雙歧桿菌的mRNA的量都少。說明因為腹瀉，仔豬腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量減少，腹瀉影響了仔豬腸道環(huán)境微生態(tài)的平衡和健康[5]。

圖1 樣本中雙歧桿菌擴增CT值示意圖

圖2 樣本中乳酸桿菌擴增CT值示意圖

(3)斷奶仔豬腹瀉的原發(fā)性因素主要是由于斷奶應激引起機體神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，腸道微生物區(qū)系平衡遭到破壞，造成治病菌大腸桿菌的增殖，益生菌減少，從而導致更為嚴重的腹瀉，所以補充益生菌能夠有效防治仔豬腹瀉的發(fā)生，為獸醫(yī)臨床防治斷奶仔豬腹瀉提供理論依據(jù)[6]。